ZEB2基因3′UTR區(qū)轉染對人胃黏膜上皮細胞GES-1增殖、侵襲、遷移的影響*

李素麗 周 芳 張慶瑜△ 賈文亮 張安玲 韓 磊 康春生

microRNA（miRNA）是長約22 nt的短鏈RNA，可與miRNA反應元件（miRNA response elements，MREs）互補結合，結合后能夠通過促進靶mRNA的降解和（或）抑制其翻譯而負性調控基因的表達。人們對miRNA-mRNA已有足夠的認識，但關于mRNA-miRNA反向作用卻知之甚少。已證實MREs能夠作用于miRNAs，從而調節(jié)后者的作用[1-2]。Tay等[3]證實腫瘤抑制因子PTEN假基因（PTENP1）的3′非翻譯區(qū)（UTR）能與PTEN結合相同的miRNA，以miRNA依賴的方式調控細胞PTEN和P-Akt蛋白水平。miR-200a/b/c在胃癌中低表達，通過抑制E盒結合鋅指蛋白（ZEB）的表達，調節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]。因此，本研究應用人工合成ZEB2 3′UTR轉染人胃黏膜上皮細胞GES-1，研究其對miR-200家族的調節(jié)作用，觀察并分析其對GES-1的影響，旨在從其增殖、遷移、侵襲力方面探討ZEB2 3′UTR導致正常胃黏膜上皮細胞惡性轉化的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 ZEB2 3′UTR質粒由南京金斯瑞公司合成；QIAGEN質粒提取試劑盒購自德國QIAGEN公司,Trizol試劑及轉染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，ZEB1、ZEB2單克隆抗體購自美國Abcam公司，基質金屬蛋白酶（MMP）-2/9、增殖細胞核抗原（PCNA）及相應二抗均購自中杉金橋公司；dNTP mixture、反轉錄酶（MMLV）、RNase抑制劑購自大連Takara公司，逆轉錄引物及qRT-PCR引物、熒光定量miRNA PCR試劑盒、miR-200b micmics購自上海吉瑪制藥技術有限公司；matrigel購自美國BD公司；GES-1由天津醫(yī)科大學神經腫瘤研究所饋贈。

1.2 方法

1.2.1 質粒的構建與提取 利用GenBank數據庫檢索ZEB2基因序列（Gen Bank,NM_001171653.1,NM_014795.3）找出其3′UTR含miR-200家族的結合序列全長，選用PGL3-Control表達載體。將序列交由南京金斯瑞公司合成，見圖1。根據QIAGEN質粒中提試劑盒說明書進行質粒的提取與純化。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與分組處理 GES-1細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于含5%CO2，37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第一部分：檢測ZEB2 3′UTR轉染后對ZEB1/ZEB2 mRNA、蛋白水平及miR-200a/b/c的影響；實驗分為對照組、突變組和ZEB2 3′UTR組。第二部分：驗證miR-200b在ZEB2 3′UTR轉染后調節(jié)增殖、侵襲、遷移中的作用；實驗分為對照組、ZEB2 3′UTR組、ZEB2 3′UTR+無義序列組、ZEB2 3′UTR組+miR-200b micmics組。根據Lipofectamine2000轉染試劑說明書進行轉染，繼續(xù)處理細胞48 h后進行下一步實驗。

1.2.3 qRT-PCR檢測細胞miR-200a/b/c及ZEB1/ZEB2的表達變化 Trizol法提取待測細胞總RNA，按試劑盒說明書應用ZEB1、ZEB2、miR-200a/b/c特異性逆轉錄、PCR引物及相應組分配置反應體系。microRNA逆轉錄條件：16℃30 min，42℃30 min，85℃10 min。所得逆轉錄產物cDNA行qRTPCR檢測各組miR-200a/b/c的表達水平，反應條件：95℃10 min；95℃15 s，65℃30 s，72℃30 s；共40個循環(huán)。ZEB1、ZEB2 cDNA模板合成條件：42℃1 h。PCR擴增，其特異性引物序列，見表1。擴增條件：94℃12 min，94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，共40個循環(huán)；72℃延伸5 min。分別以U6、GAPDH作為內參，結果判定采用2－ΔΔCT法。

Figure 1 Schematic representation of the ZEB2 3′UTR plasmid constructs圖1 ZEB2 3′UTRs區(qū)質粒構建示意圖

Table 1 The qRT-PCR primers sequences of ZEB1/ZEB2/GAPDH表1ZEB1、ZEB2、GAPDH qRT-PCR引物序列

1.2.4 Western blot檢測細胞蛋白表達水平 用細胞裂解液RIPA裂解提取待測細胞的總蛋白。SDS-PAGE凝膠電泳分離，恒壓80 V電轉移至PVDF印跡膜。膜封閉液封閉1 h后，加入一抗ZEB1、ZEB2、MMP2/9、PCNA、GAPDH（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。用辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000稀釋），室溫孵育1 h，凝膠成像系統(tǒng)采集成像。GAPDH蛋白作為內參。以目標蛋白條帶灰度值/同一樣本內參條帶灰度值計算目標蛋白相對表達量。

1.2.5 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 在Transwell上室聚碳酸酯濾膜（孔徑8 μm）上加入預冷無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的Matrigel基質膠（Matrigel∶DMEM=1∶2）100 μL，37℃30 min后待其凝固，接種100 μL無血清培養(yǎng)基稀釋GES-1細胞（1×106個/mL），下室加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，每組設3個復孔。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，棄去上室液體，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，蘇木精染色。DP-70熒光相差倒置顯微鏡（×100）采集圖像，隨機讀取3個視野，計算穿過膜的細胞數。

1.2.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將已轉染的細胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。次日用200 μL微量移液槍頭在6孔板內垂直及平行劃痕，PBS液洗滌2次后加入無血清培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下觀察0、48 h后劃痕兩側細胞的遷移情況并拍照。距離差除以2為細胞相對遷移距離，計算細胞相對遷移率（相對遷移率=相對遷移距離/0 h時劃痕邊緣距劃痕中線距離），重復3次并進行統(tǒng)計分析。

1.2.7 MTT法檢測細胞增殖活性 取對數生長期細胞，常規(guī)胰酶消化制成單細胞懸液，細胞以4×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL培養(yǎng)基，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后轉染。取3組細胞測其吸光度（A）值，每組3個復孔，每24 h測1次。測時每孔加入20 μL（5 g/L）MTT，溫育4 h后，棄去培養(yǎng)基，加入200 μL DMSO，振蕩10 min。在酶標儀上測490 nm處各孔的A值，計算生長增殖率=（實驗組A490值/對照組A490值－1）×100%。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對數據進行分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，3組及以上數據間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 轉染ZEB2 3′UTR對GES-1細胞miR-200a/b/c及ZEB1、ZEB2 mRNA表達水平的影響 結果顯示，轉染ZEB2 3′UTR后，GES-1細胞中miR-200a/b/c表達水平較對照組及突變組明顯下降，以miR200b下調最為顯著（均P＜0.01），突變組較對照組無明顯改變，見圖2。ZEB1及ZEB2 mRNA表達水平較對照組及突變組明顯上升（均P＜0.01），見圖3。

2.2 Western blot檢測轉染ZEB2 3′UTR后ZEB1/ ZEB2蛋白表達變化 轉染ZEB2 3′UTR后，GES-1細胞中ZEB1和ZEB2蛋白相對表達水平較對照組、突變組明顯升高（P＜0.01），見圖4、表2。

2.3 轉染ZEB2 3′UTR及恢復miR-200b micmics表達后對細胞侵襲、遷移能力的影響 ZEB2 3′UTR+ miR-200b micmics組miR-200b的表達水平高于其他3組，見圖5。Transwell體外侵襲實驗檢測轉染后穿過微孔的平均細胞數目，結果顯示，ZEB2 3′UTR組較對照組均明顯升高，而聯(lián)合miR-200b micmics后，穿過小室的細胞數較ZEB2 3′UTR組明顯減少（均P＜0.01），見圖6、表3。劃痕實驗結果顯示，48 h后ZEB2 3′UTR組細胞運動速度明顯快于對照組，遷移率顯著升高，而恢復miR-200b表達后，其遷移能力有所下降（P＜0.01），見圖6、表3。且MMP2/9侵襲指標也出現相應變化，見圖7、表4。

Figure 2 Comparison of miR-200a/b/c expression levels between three groups圖2 各組細胞的miR-200a/b/c表達水平比較（n=3）

Figure 3 Comparison of ZEB1 and ZEB2 expression levels between three groups圖3 各組細胞的ZEB1、ZEB2表達水平比較（n=3）

Figure 4 The protein expression levels of ZEB1/ZEB2 in three groups圖4 3組細胞內ZEB1/ZEB2蛋白表達水平

Table 2 Comparison of protein expression levels of ZEB1/ZEB2 between three groups表2 各組細胞中ZEB1/ZEB2蛋白表達水平比較（n=3，±s）

Table 2 Comparison of protein expression levels of ZEB1/ZEB2 between three groups表2 各組細胞中ZEB1/ZEB2蛋白表達水平比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與突變組比較，P＜0.05

組別對照組（1）突變組（2）ZEB2 3′UTR組（3）F ZEB1相對表達量0.23±0.02 0.22±0.01 0.41±0.07ab 35.344＊＊ZEB2相對表達量0.10±0.03 0.10±0.07 0.19±0.02ab 40.700＊＊

Figure 5 The expression levels of miR-200b evaluated by qRT-PCR in four groups圖5 qRT-PCR檢測不同處理組miR-200b的表達水平

Table 3 Comparison of the invasive capability and migrating rates after transfection between four groups表3 4組轉染后細胞侵襲能力及細胞遷移率比較（n=3，±s）

Table 3 Comparison of the invasive capability and migrating rates after transfection between four groups表3 4組轉染后細胞侵襲能力及細胞遷移率比較（n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與（1）組比較，b與（2）組比較，c與（3）組比較，P＜0.01；表4同

組別對照組（1）ZEB2 3′UTR組（2）ZEB2 3′UTR+無義序列組（3）ZEB2 3′UTR+200b micmics組（4）F穿膜細胞數（個）45.67±3.21 76.33±3.78a 77.33±2.51a 47.33±3.79bc 81.353＊＊48 h遷移率（%）24.91±2.56 52.45±2.63a 54.01±3.10a 26.33±3.02bc 94.602＊＊

2.4 MTT檢測轉染后細胞增殖活性 4組之間A490值于第1天差異無統(tǒng)計學意義（F=0.995，P＞0.05），第2～6天差異均有統(tǒng)計學意義（F分別為8.630、18.377、11.925、24.545、35.058，均 P＜0.01）；且ZEB2 3′UTR組A490值于第2～6天較對照組及ZEB2 3′UTR+miR-200b micmics組顯著升高（均P＜0.01）；而ZEB2 3′UTR+miR-200b micmics組A490值于第1～6天和對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖8。相應反映增殖能力指標的PCNA蛋白與生長曲線一致，出現相應變化，見圖7、表4。

Figure 6 Comparison of trans-membrane cell numbers and migrating rates between four groups（×100）圖6 4組細胞中穿過小室細胞數及遷移率比較（×100）

Figure 7 The protein expression levels of MMP2/9 and PCNA in four grouops圖74組細胞內MMP2/9及PCNA蛋白表達水平

Figure 8 The growth curves of GES-1 in different groups圖8 不同處理組GES-1細胞的生長曲線

Table 4 Comparison of protein expression levels of MMP2/9 and PCNA between four groups表4 各組細胞中MMP2、MMP9和PCNA蛋白表達水平比較（n=3，±s）

Table 4 Comparison of protein expression levels of MMP2/9 and PCNA between four groups表4 各組細胞中MMP2、MMP9和PCNA蛋白表達水平比較（n=3，±s）

組別對照組（1）ZEB2 3′UTR組（2）ZEB2 3′UTR+無義序列組（3）ZEB2 3′UTR+miR-200b micmics組（4）F MMP2 0.28±0.02 0.53±0.01a 0.55±0.05a MMP9 0.36±0.03 0.69±0.03a 0.67±0.04a PCNA 0.63±0.03 1.03±0.05a 1.01±0.06a 0.30±0.03bc 77.993＊＊0.39±0.02bc 107.487＊＊0.66±0.02bc 69.147＊＊

3 討論

3.1 mRNA-miRNA反向作用的機制 近期提出的競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceR?NA）假說認為：mRNA、被轉錄的假基因和長的非編碼RNA之間能夠通過競爭miRNA的方式進行交互對話，這種作用依賴于“MREs”[6]。RNA之間通過競爭性結合相應的miRNA，對該miRNA的后續(xù)轉錄后調控作用發(fā)生有效的控制。Sumazin等[7]繪制出了惡性膠質瘤細胞中RNA相互作用網絡，有超過7 000種基因編碼RNA以借助miRNA的方式發(fā)生了相互作用，與癌癥相關的基因起著重要的調控作用，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。

3.2 3′UTR在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的調節(jié)作用 PTENP1的3′UTR及PTEN ceRNA ZEB2能與PTEN結合相同的miRNA，以miRNA依賴的方式調控細胞內PTEN和P-Akt蛋白水平；其缺失可致PI3K/AKT信號激活，誘導腫瘤發(fā)生[3,8]。外源性表達“miRNA海綿”能夠有效特異地抑制miRNA的功能[9]。含MREs的3′UTR具有強大的生物學活性，成為miRNA“誘餌”，螯合miRNA，從而影響它們對所表達的基因的調控。本研究中轉染ZEB2 3′UTR后，ZEB1/ZEB2 mRNA及蛋白水平均升高，可能與上述機制有關。

3.3 ZEB2 3′UTR對細胞惡性轉化的影響及可能機制 本研究轉染ZEB2 3′UTR質粒后，miR-200a/b/c表達下調，以miR-200b降低最為明顯，此變化可能與2種因素有關：一方面，特異的miRNA結合位點結構與miRNA結合后觸發(fā)miRNA加尾和3′→5′修剪及亞細胞定位而影響miRNA的穩(wěn)定性有關[10-11]；另一方面，ZEB1/ZEB2能結合miR-200b/200a/429啟動子區(qū)以調節(jié)其表達[12]，ZEB2 3′UTR的導入引起miR-200家族表達降低，進而減弱其對ZEB1/ZEB2的抑制作用，升高的ZEB1/ZEB2則進一步加強了其對miR-200家族成員的表達抑制作用，形成一個正反饋調節(jié)作用。恢復miR-200b表達后，細胞惡性轉化能力部分被逆轉，ZEB2 3′UTR對miR-200b的調控可能是其發(fā)揮作用的主要機制之一。

ZEB2 3′UTR可以促進人胃黏膜上皮細胞的惡性轉化傾向，此作用可能與轉染ZEB2 3′UTR后調控miR-200家族進而影響相應的靶基因ZEB1/ZEB2的表達有關。本研究證實了非編碼轉錄在基因規(guī)模上的影響，有望為抑制GES-1細胞惡性轉化提供新的途徑或方法。

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