馬鹿茸水溶性蛋白的提取與體外模擬消化研究

王 旋，趙 磊，王成濤（北京工商大學北京市食品添加劑工程技術研究中心，食品質量與安全北京實驗室，北京100048）

馬鹿茸水溶性蛋白的提取與體外模擬消化研究

王 旋，趙 磊*，王成濤
（北京工商大學北京市食品添加劑工程技術研究中心，食品質量與安全北京實驗室，北京100048）

以鮮馬鹿茸為原料，對比六種蛋白提取方法，依據提取蛋白量及SDS-PAGE電泳圖譜確定鹿茸水溶性蛋白有效提取方法；模擬胃腸環境對提取的蛋白進行體外模擬消化研究，測定其體外胃腸消化穩定性及消化過程中游離氨基含量變化。結果表明：組成為100mmol/L Tris、6mol/L鹽酸胍、0.02mol/L EDTA-2Na和1%胃蛋白酶抑制劑的提取液提取蛋白量最高，電泳條帶多且清晰；蛋白在體外模擬胃、腸環境下消化5min后即迅速被分解，消化60min后即被分解為20ku以下的小分子量蛋白或多肽，消化2.5h后分子量主要分布在7823u及以下范圍，在腸和胃腸連續消化過程中游離氨基含量隨時間的延長而顯著增加，這表明鹿茸水溶性蛋白較易被分解；模擬腸消化2.5h后游離氨基含量增加了一倍，顯著大于胃消化中的增加量（p＜0.01），這暗示著鹿茸水溶性蛋白更有利于腸消化。

馬鹿茸，水溶性蛋白，電泳，體外模擬消化，游離氨基

鹿茸為脊索動物門哺乳綱鹿科的動物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生絨毛的幼角，與人參、靈芝、冬蟲夏草和阿膠共稱為中華養生五大圣品。鹿茸化學成分復雜，含有蛋白質、糖胺聚糖、磷脂、脂肪酸、激素樣物質、核酸、多胺及各種無機物質[1]，其中鹿茸蛋白是最主要的化學成分，占干重的52%以上[2]。近年來一系列研究發現，鹿茸具有免疫調節、抗炎、抗氧化、抗衰老等多種生物學功能[3-6]，有廣泛的應用前景和巨大的市場價值。蛋白質和多肽在生命活動中起著重要的作用，研究表明鹿茸蛋白質和多肽在鹿茸的保健功能中占著極其重要的地位[7]。潘曉光[8]通過淋巴細胞增殖、細胞因子產生等實驗確定鹿茸多肽對機體具有免疫增強作用。路來金等[9]研究發現鹿茸多肽可明顯促進神經干細胞向神經元分化，提高分化細胞數量，從而促進神經系統損傷后的修復和再生。李振華等[10]報道鹿茸多肽對骨關節炎軟骨細胞的氧化損傷有逆轉作用，且在一定范圍內呈現劑量依賴性。然而，現有對于鹿茸的研究多集中于其脂溶性成分及天然存在的生物活性肽，而高含量的蛋白質常被忽視，其消化吸收性質尚鮮有報道。動物異源蛋白在理論上存在免疫排斥反應等問題，這也是開發利用鹿茸蛋白產品的重要研究和控制點。現有對鹿茸蛋白及多肽的研究多集中于活性成分分析和保健作用的研究[11]，市場上亦開始流行鹿茸蛋白保健品，而作為我國傳統滋補良品，鹿茸的價格也比較昂貴，那么對高效提取鹿茸蛋白及其在體內的消化吸收情況的研究顯得尤為重要。

本實驗采用不同方法提取鹿茸蛋白，根據蛋白提取量和SDS-PAGE電泳圖譜優化鹿茸水溶性蛋白提取方法；通過模擬胃腸道消化過程，分析鹿茸水溶性蛋白的消化穩定性以及消化過程中游離氨基含量變化，評價鹿茸水溶性蛋白的消化特性和營養價值，為進一步研究和開發鹿茸產品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮馬鹿茸 由大興安嶺區科技局提供；牛血清蛋白Ⅴ組分、EDTA-2Na、鹽酸胍 Amresco公司；胃蛋白酶（酶活力為2500U/mg pro）、胰酶、胃蛋白酶抑制劑Pepstatin A、Tricine Sigma公司；Protein Marker

北京全式金生物技術有限公司；二硫蘇糖醇（DTT） Inalco公司；其他試劑 均為國產分析純。

FD-1B-80型冷凍干燥機 南京普森儀器；TGL-10C型高速臺式離心機 上海智城分析儀器制造有限公司；Sorvall Legend Micro 17R型微量離心機 Thermo公司；UV-2450型紫外可見光分光光度計 日本島津；Bio-Rad型電泳儀 北京伯樂生命科學發展有限公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋 金壇市科興儀器廠；HQ45型恒溫搖床 中國科學院武漢科學儀器廠；ATN-300型全自動凱氏定氮儀 上海洪紀儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹿茸水溶性蛋白的制備 取新鮮馬鹿茸經冷凍干燥后低溫粉碎制成鹿茸粉末。稱取1g鹿茸粉末放入50mL離心管中，分別加入8mL 4℃預冷的六種不同蛋白提取液（表1），4℃浸提36h，4500r/min離心30min，取上清液。經梯度鹽析、透析、冷凍干燥得鹿茸水溶性蛋白，低溫密封保存。根據蛋白提取量及電泳圖譜確定有效提取方法。

1.2.1.1 樣品蛋白含量測定 取上述浸提蛋白的上清液，采用考馬斯亮藍（Bradford）法[12]測定樣品蛋白含量。

1.2.1.2 SDS-PAGE電泳法測蛋白質分子量分布 配制12%分離膠和5%濃縮膠，取1mg/mL蛋白溶液與樣品緩沖液混合，100℃加熱5min，上樣前12000r/min離心1min，上樣量為10μL。剛開始設置電壓為80V，當溴酚藍到達分離膠時電壓設置為120V，當溴酚藍到達分離膠底部時結束電泳。電泳后進行考馬斯亮藍R-250染色（染色液：1.0g考馬斯亮藍R-250，450mL甲醇，450mL蒸餾水，100mL冰醋酸）20min，脫色（10%甲醇；10%冰醋酸）3h。

1.2.2 蛋白質穩定性的測定 根據美國藥典配制模擬胃腸消化液[13]，模擬胃液（SGF）：0.2g NaCl，0.32g胃蛋白酶，700μL濃鹽酸，70mL蒸餾水，用鹽酸調pH為

1.2 ，加蒸餾水定容至100mL。

模擬腸液（SIF）：0.7g磷酸二氫鉀溶于25mL蒸餾水，加入19mL 0.2mol/L氫氧化鈉溶液和40mL蒸餾水，加入1.0g胰酶，用0.2mol/L氫氧化鈉溶液調pH至7.5，加蒸餾水定容至100mL。

采用SDS-PAGE電泳測蛋白質模擬胃消化過程中分子量的變化，同1.2.1.2。同時，利用Tricine-SDSPAGE電泳共同分析低分子量蛋白質和多肽的分布。根據資料[14]配制16.5%分離膠、10%夾層膠、4%濃縮膠及陰極、陽極緩沖液，取1mg/mL蛋白溶液與樣品緩沖液混合100℃加熱5min，上樣量為10μL。電泳初始電壓設為70V，當樣品到達分離膠時電壓設為100V，當溴酚藍到達分離膠底部時結束電泳。取出凝膠浸泡在固定液（50%乙醇，10%冰醋酸）中固定30min，然后染色20min，最后脫色至凝膠上背景脫凈為止。

1.2.3 游離氨基含量的測定 采用茚三酮法[15]測定鹿茸水溶性蛋白模擬胃腸消化過程中的游離氨基含量變化，表征蛋白胃腸消化率。取干燥的亮氨酸（Leu）溶于蒸餾水配制成20mg/mL的溶液，稀釋成含量為4、8、12、16、20μg/mL的溶液用于標準曲線繪制。每管加入2mL標準溶液和1mL新鮮配制的茚三酮溶液（0.5%茚三酮，11.2%Na2HPO4·12H2O，6%KH2PO4和0.3%果糖），混勻后于沸水浴中加熱15min，然后冷水冷卻。冷卻后加入5mL 40%（v/v）乙醇溶液混勻，放置15min，同時作空白對照，用1cm比色杯以空白管調零于570nm處測定吸光值。用樣品代替Leu標準溶液，其余操作同上，利用標準曲線計算水解蛋白液中-NH2基含量（mmol/g）。

表1 蛋白提取液的組成Table 1 The compositions of protein extracts

1.2.4 統計分析 每個實驗至少重復三次，數據采用SPSS18.0軟件分析，結果以均值±標準偏差（Mean± SD）表示，組間數據比較用單因素方差分析，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 鹿茸水溶性蛋白提取方法比較

利用Bradford法測定不同提取方法的蛋白質濃度，結果如表2所示。將六種提取產物進行SDS-PAGE電泳，電泳圖譜見圖1。表2顯示，方法3和4所提取的蛋白量顯著高于其他四種方法，分別為（0.345±0.023）g和（0.342±0.015）g，但兩者無顯著性差異（p＞0.05）。SDS-PAGE電泳（圖1）呈現了六種不同提取液所提取的蛋白質分子量分布情況，顯然方法3和4條帶較清晰且分布較廣。方法3所提取的蛋白分子量主要分布在45～120ku之間，與方法4的條帶相比顏色較淺；方法4所提取的蛋白在40～120ku分子量范圍內有多條條帶分布，顏色深且清晰，在25～30ku范圍內也有較寬的條帶分布，在14ku左右亦有條帶分布，顯然該方法提取的成分更復雜。綜合蛋白提取量和蛋白分子量分布情況分析，方法4（100mmol/L Tris＋6mol/L鹽酸胍＋0.02mol/L EDTA-2Na＋1%胃蛋白酶抑制劑）為本實驗提取鹿茸中水溶性蛋白的有效提取方法。

圖1 不同方法提取的鹿茸蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE electrophoretogram of velvet antler protein with different extracts

2.2 鹿茸水溶性蛋白在體外模擬消化中的穩定性

現有研究表明，鹿茸蛋白和多肽具有免疫增強、神經保護、抗骨質疏松、抗炎抗衰老等藥理作用[16]，在開發功能性食品方面有廣泛的應用前景。而作為滋補良品，鹿茸蛋白的消化特性和致敏性尚鮮有報道。對于食品消化性能和致敏性評估的具體方案，其中一項就是評估目的蛋白在模擬胃腸中的消化穩定性。食物中若含有不易消化的致敏性蛋白，則極易引起人體的過敏反應。不能被胃蛋白酶降解的蛋白質或降解片段大于3.5ku的蛋白質可能是致敏蛋白[17-18]。本實驗通過分析鹿茸蛋白體外模擬消化過程中分子量變化評價其消化穩定性。

2.2.1 蛋白質在模擬胃液中的穩定性 采用方法4獲得鹿茸水溶性蛋白，進行體外模擬消化檢測其在模擬胃液中的穩定性，凝膠電泳圖譜如圖2所示。鹿茸水溶性蛋白主要分布在40～120ku之間（圖2A），在14.4～20.1ku處也有清晰條帶分布（圖2B）。加胃蛋白酶開始消化5min后蛋白質迅速分解，40ku以上大分子量蛋白基本消失（圖2A），40ku處存在一清晰條帶與泳道1中胃蛋白酶位置相一致，該條帶始終存在于消化不同時間的模擬胃消化物中，推測其為胃蛋白酶條帶。在模擬胃消化的時間內（10min～2.5h），分布在14～30ku之間的蛋白條帶顏色逐漸變淺（圖2A），而低于20.1ku的低分子量蛋白條帶增加且顏色逐漸加深，在14.4ku附近新出現兩個條帶，樣品蛋白消化1h以后7.8ku以下蛋白條帶顏色明顯加深（圖2B）。由圖2可以看出，大分子量的蛋白質可以在較短時間內被胃蛋白酶消化分解成為較小分子量的蛋白質和多肽，但在消化2.5h后仍有分解物分子量在14.4ku左右。

圖2 鹿茸水溶性蛋白及其模擬胃消化的電泳圖譜Fig.2 Electrophoretogram of velvet antler water soluble protein and its simulated gastric digests

2.2.2 蛋白質在模擬腸液中的穩定性 模擬腸消化過程中鹿茸水溶性蛋白質分子量變化的凝膠電泳圖譜如圖3所示。

表2 不同方法提取的鹿茸水溶性蛋白含量Table 2 The contents of velvet antler water soluble protein with different extracts

綜合分析圖3，開始消化5min后鹿茸水溶性蛋白中的大分子蛋白迅速被分解，蛋白條帶主要分布于40ku以下（圖3A），14ku以下亦有模糊條帶出現（圖3B）。在樣品消化過程中，分子量在25、30ku附近及40ku下方一直存在微弱條帶，并與胰酶的電泳條帶相對應，推測其為消化酶。隨著消化時間的延長，25ku上方的蛋白條帶顏色逐漸變淺并模糊（圖3A），在消化30min之后，蛋白條帶主要集中于14ku以下。消化1.5h后，5.8ku以下蛋白條帶顏色加深，樣品蛋白已基本被分解為小分子蛋白質和多肽。

圖3 鹿茸水溶性蛋白及其模擬腸消化的電泳圖譜Fig.3 Electrophoretogram of velvet antler water soluble protein and its simulated intestinal digests

2.2.3 模擬胃腸道連續消化前后鹿茸蛋白的分子量變化 凝膠電泳分析鹿茸水溶性蛋白在模擬胃腸連續消化過程中分子量變化，見圖4。在圖4A中一直存在于30ku附近的條帶以及圖4B標注出的條帶為消化酶。圖4A顯示，胃消化30min，蛋白樣品中大分子蛋白減少，蛋白質分子量主要集中于40ku以下；加入胰酶消化后，大分子蛋白消失，在SDS-PAGE圖譜中已看不到條帶。從圖4B可以看出，在開始繼續腸消化10min后，14.4ku以下的條帶分布增多、顏色加深；在消化2h后，原來位于20.1ku上方的條帶消失，鹿茸水溶性蛋白模擬胃腸消化物的分子量主要集中在14.4ku以下，7.8ku及以下條帶顏色加深。

綜合分析電泳結果，在模擬胃腸連續消化過程中，隨著消化時間的延長鹿茸水溶性蛋白的水解程度增加，大分子蛋白易被分解為小分子蛋白質和多肽。但在消化2h后，鹿茸水溶性蛋白模擬胃、腸獨立消化產物和連續消化產物在7.8ku及以上仍有分布。王金梅等[19]研究表示大豆蛋白在消化2h后仍有分子量在25ku的蛋白未分解，而菜籽蛋白則全部被降解形成分子量更小的多肽。這表明鹿茸水溶性蛋白比大豆蛋白更易被水解，但其并不易被徹底消化直接吸收，這也有可能是體外模擬消化環境較簡單、消化時間較短所致。FAO/WHO專家咨詢委員會指出：對外源蛋白，不能被胃蛋白酶降解的蛋白質或降解片段大于3.5ku的蛋白質可能是致敏蛋白[18]。因為模擬胃腸液的成分、消化酶活性、目的蛋白與消化酶比例等均是影響結果的重要因素，且與胃腸實際環境差別較大，因此，鹿茸水溶性蛋白是否具有一定的致敏性，仍需進一步探討。

圖4 鹿茸水溶性蛋白及其模擬胃腸消化的電泳圖譜Fig.4 Electrophoretogram of velvet antler water soluble protein and its simulated gastrointestinal digests

2.3 鹿茸水溶性蛋白游離氨基含量在模擬胃腸消化過程中的變化

蛋白質消化率是指一種食物蛋白質可被消化酶分解的程度，是評價食物營養價值的重要指標之一。蛋白質消化率越高，被人體吸收利用的可能性也就越大[20]。鹿茸作為我國傳統的滋補良品，測定其蛋白質的消化率有助于提高原料的利用率、減少浪費、降低成本，且為今后鹿茸的營養成分的研究奠定基礎。

本實驗對鹿茸水溶性蛋白進行體外模擬胃、腸消化實驗，根據消化過程中游離氨基含量變化表征胃腸消化率評價其消化特性。在胃和腸消化環境下鹿茸蛋白游離氨基含量變化情況如圖5所示。鹿茸水溶性蛋白中游離氨基含量約為（0.53±0.02）mmol/g，在體外模擬胃消化0.5h后達到（0.66±0.01）mmol/g，游離氨基含量顯著增加（p＜0.01）。在消化至1.5h和2.5h時游離氨基的含量分別為（0.74±0.02）mmol/g和（0.75± 0.01）mmol/g，兩者無顯著差異（p＞0.05），說明在1.5h后消化趨于穩定，但仍在較低水平，這表明鹿茸水溶性蛋白不易被胃蛋白酶水解。在模擬腸消化過程中游離氨基的量隨時間的延長而顯著增加，在消化2.5h后到達（1.09±0.02）mmol/g，較消化前增加了一倍，且仍呈上升趨勢，并顯著高于胃消化穩定后的游離氨基含量（p＜0.01），這表明鹿茸水溶性蛋白在模擬腸消化中的水解度高于胃消化。

圖5 鹿茸水溶性蛋白中游離氨基含量在模擬胃和腸消化過程中的變化Fig.5 Changes in the content of α-NH2during simulated gastric and intestinal digestion of velvet antler water soluble protein

在模擬胃腸連續消化過程中游離氨基含量變化如圖6所示。游離氨基的量在胃消化階段變化較小，而在進入腸消化階段的1h內迅速由（0.74±0.02）mmol/g增加至（1.27±0.05）mmol/g。繼續腸消化游離氨基含量持續增加，在消化5.5h后達到（1.56±0.03）mmol/g，并保持穩定。分析模擬消化過程中游離氨基含量的變化表明，在相同消化時間下，鹿茸蛋白在模擬胃腸連續消化中的水解程度高于單一的胃和腸消化；蛋白質在胃中消化程度較低，主要是將大分子蛋白質高級結構解鏈分解為較低分子量的蛋白質和多肽；蛋白質的消化主要是在后續的小腸中進行，該結果暗示著鹿茸水溶性蛋白更有利于體內腸消化。

圖6 鹿茸水溶性蛋白中游離氨基含量在模擬胃腸連續消化過程中的變化Fig.6 Changes in the content of α-NH2during simulated gastrointestinal digestion of velvet antler water soluble protein

3 結論

本研究通過多種蛋白提取方法對比實驗和體外模擬蛋白消化模型，確定最優馬鹿茸水溶性蛋白的提取方法及蛋白的消化特性。結果表明，鹿茸水溶性蛋白的優化的提取液組成為：100mmol/L Tris+6mol/L鹽酸胍+0.02mol/L EDTA-2Na+1%胃蛋白酶抑制劑，提取蛋白量為（0.342±0.015）g/g干鹿茸。樣品大分子量蛋白在胃和腸消化中5min后即迅速被分解，消化60min后蛋白質主要分布在20ku以下，5.8ku以下的多肽迅速增加。鹿茸水溶性蛋白在胃中被消化程度較低，加入胰酶后水解程度變大，更易于腸消化。但在消化2.5h后鹿茸水溶性蛋白質模擬胃腸消化物分子量在7.8ku及以上仍有分布，分子量較大，直接口服鹿茸水溶性蛋白可能不易被充分吸收。

目前對鹿茸水溶性蛋白研究開發還較少，本文對其提取方法及體外模擬消化特性進行了初步探索，為鹿茸的進一步研究開發提供理論基礎。鹿茸作為我國傳統的滋補良品，將實驗結果結合已證實的功能作用和良好的消化特性，將具有更廣的利用空間和價值。

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圖8 有機磷農藥抑制率曲線Fig.8 Curve of inhibition rate of organophosphate

2.3.2 酶電極的重現性和穩定性 選擇一個酶電極，測定其對相同底液的響應電流，每隔20min測定一次，連續測6次，得出其響應電流，其相對標準偏差為7.8%。說明該酶傳感器具有良好的重現性。另外選擇一個修飾好的酶電極于PBS溶液內，置于4℃冰箱中保存，10d后再次測定其響應電流，可以達到原響應電流的87%，說明該酶電極具有較好的穩定性。

2.3.3 酶電極對實際樣品的回收率測定 取洗凈的樣品（不含有機磷農藥的白菜和胡蘿卜），用刀切成小片，在其上滴適量一定濃度的樂果農藥，置于小燒杯中，并加入適量的丙酮溶液浸泡，密封靜置12h。以上述配制的溶液為待測的實際樣品，在0.1mol/L PBS緩沖溶液中采用三電極系統對樣品進行回收率測定。本實驗分別對白菜和胡蘿卜進行了平行五次測定，由表1可知，該方法的回收率分別為94.74%、101.68%，說明該有機磷生物農藥傳感器對樣品中農藥殘留含量的測定具有良好的準確度。

表1 蔬菜樣品回收率實驗結果Table 1 Results of vegetable sample recovery

3 結論

本研究將硫堇聚合于玻碳電極表面制備了可用于蔬菜中有機磷殘留檢測的電化學酶傳感器，該傳感器具有響應快、靈敏度高，并具有較好的穩定性。將該傳感器用于蔬菜樣品中有機磷農藥樂果的快速檢測，顯示出較高的準確性。

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Extraction and in vitro simulated gastrointestinal digestion of velvet antler water-soluble protein

WANG Xuan，ZHAO Lei*，WANG Cheng-tao
（Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives，Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

The optimal extract method of velvet antler water-soluble protein was determined in this study according to the protein content and SDS-PAGE electrophoresis of six extracts./n vitro simulated gastrointestinal digestion of velvet antler water-soluble protein was investigated in terms of digestibility and free α-amino nitrogen content.Results showed that the extract obtained with the solution composed of 100mmol/L Tris，6mol/L guanidine hydrochloride，0.02mol/L EDTA-2Na and 1%Pepstatin A had the largest protein content and clearest electrophoresis bands.The protein was rapidly hydrolyzed in 5min by in vitro simulated gastrointestinal digestion，and then it was broken into small proteins and peptides less than 20ku in 60min.The hydrolysate mainlydistributed below 7823u after2.5h，and the free α-amino nitrogen contentwasincreased significantly during both intestinal and gastrointestinal digestion.The content of free α-amino nitrogen had doubled after simulating intestinal digestion for 2.5h，and was significantly higher than the increment in gastric digestion（p＜0.01）.The results indicated that water-soluble protein of velvet antler was easily hydrolyzed and more suitable for intestinal digestion.

velvet antler；water-soluble protein；electrophoresis；in vitro simulated gastrointestinal digestion；free α-amino nitrogen

TS201.4

A

1002-0306（2014）12-0081-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.008

2013－09－26 *通訊聯系人

王旋（1991-），女，碩士研究生，研究方向：功能性食品。

國家自然科學基金青年科學基金項目（31201324）；北京市教育委員會科技計劃面上項目（KM201210011008）。