改性殼聚糖為載體制備喹乙醇分子印跡聚合物及其表征

趙冬艷，喬旭光，徐志祥，安艷冬（.浙江醫藥高等專科學校生物與食品系，浙江寧波3500；.山東農業大學食品科學與技術學院，山東泰安7000）

改性殼聚糖為載體制備喹乙醇分子印跡聚合物及其表征

趙冬艷1，喬旭光2，*，徐志祥2，安艷冬2
（1.浙江醫藥高等專科學校生物與食品系，浙江寧波315100；2.山東農業大學食品科學與技術學院，山東泰安271000）

以交聯化殼聚糖微球為表面載體，水和乙腈為混合溶劑，將模板分子（喹乙醇），功能單體（丙烯酰胺）及交聯劑（N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺）采用表面分子印跡與溶膠-凝膠法合成喹乙醇分子印跡聚合物（MIP）。并對新型水相分子印跡聚合進行紅外光譜、掃描電鏡、吸附動力學實驗、吸附平衡實驗、選擇性實驗的表征。實驗結果表明：以殼聚糖為載體的分子印跡聚合物對喹乙醇的吸附容量為10.14mg·g-1，對喹烯酮的印跡效率因子為2.29，乙酰甲喹的印跡效率因子為2.22。以殼聚糖為載體的分子印跡聚合物具有較高識別選擇能力，對喹乙醇具有快速吸附效果。

殼聚糖，喹乙醇，分子印跡聚合物，表征

喹乙醇（olaquindox）是一種抗菌促生長劑，在我國作為飼料添加劑被廣泛用于畜禽及水產品的養殖。一度被稱為“水產品中的瘦肉精”，大量生物毒性實驗表明，喹乙醇可在動物體內形成蓄積，有致突變、致畸和致癌性[1-2]。歐盟、日本禁止使用喹乙醇[3]，《中國獸藥典》（2005版）中明確規定，喹乙醇被禁止用于家禽及水產養殖。目前國內外對喹乙醇的檢測研究報道不多，主要采用高效液相色譜法[4-5]、高效液相串聯質譜法[6-8]以及免疫分析法[9-10]等，上述方法存在各自的優缺點，因此，快速、簡單并對目標物有選擇性分離和富集的前處理技術有必要進行積極開發，其中分子印跡技術即是一種在快速檢測中對目標物有較好的選擇性富集作用的新型技術。

分子印跡聚合物（MIPs）是仿照抗體的形成機理，人工合成的對目標分子具有高選擇識別性能的高聚物，具有一定的機械穩定性、熱穩定性和較好的特異性[11]。殼聚糖是一種天然聚陽離子堿性多糖，含有大量羥基和氨基，對殼聚糖進行交聯改性可以使殼聚糖對許多物質都具有離子交換、螯合和吸附等作用[12]。以交聯化殼聚糖為載體，制備喹乙醇分子印跡聚合物目前未見報道。制備的分子印跡聚合物作為固相萃取材料，可以實現固相萃取對喹乙醇的選擇分離和富集，進一步與液相色譜技術聯用可以有效提高從復雜樣品對目標物的檢測限，從而為提高我國食品安全技術水平提供一定技術參考，對推動食品安全的發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

喹乙醇、乙酰甲喹、喹烯酮 分析純，中國獸醫藥品監察所；丙烯酰胺（AM）、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸（AMPS） 分析純，上海邁瑞爾化學技術有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA） 分析純，美國Sigma公司；N，N－亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）

分析純，百靈威科技有限公司；殼聚糖 上海伯奧生物科技有限公司；環氧氯丙烷 分析純，天津市巴斯夫化工有限公司；甲基丙烯酸（MAA）、三聚磷酸鈉、乙酸乙酯、冰乙酸、甲醇、乙腈、過硫酸鉀（KPS）、偶氮二異丁腈（AIBN） 分析純，天津市凱通化學試劑有限公司；聚乙二醇-2000 分析純，天津市河東區紅巖試劑廠。

UV-2450型紫外-可見分光光度計 日本島津有限公司；KA-1000型離心機 上海安亭科學儀器廠；DZF-6030A型真空干燥箱 上海一恒科技有限公司；HY-4型調速多用振蕩器 常州市華普達教學儀器有限公司；SHB-IV雙A循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；KDM型可調控溫電熱套 山東鄴城華魯電熱儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器 上海閔行虹浦儀器廠；JA1003A型電子天平 上海精天電子儀器有限公司；HH-2型數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；傅里葉變換紅外分光光度計 Thermo，USA；Cary 50-Bio型紫外分光光度計 Victoria，Australia；SS-35型掃描電子顯微鏡 Shimadzu，日本。

1.2 實驗方法

1.2.1 喹乙醇標準曲線的繪制 準確稱取50.0mg喹乙醇，于500mL棕色容量瓶用去離子水定容，配制成質量濃度為100mg·L-1標準液。用去離子水稀釋，依次配制成濃度為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20mg·L-1的標準溶液液。用紫外可見分光光度儀測定其吸光度（A）值，以去離子水作為參比，重復實驗三次取平均值，將測得的吸光度（A）值與喹乙醇濃度對應繪制標準曲線，測定波長為372nm。

1.2.2 交聯殼聚糖微球的制備方法 稱取3.0g殼聚糖，在磁力攪拌下緩慢加入到100mL 2.0%醋酸水溶液中，溶脹12h；取15mL殼聚糖醋酸溶液，超聲10min排除氣泡，采用離子交聯法，將殼聚糖醋酸溶液經醫用針頭滴入到3.0%三聚磷酸鈉溶液中，制得殼聚糖微球，靜置2h后，用pH為10的無水乙醇浸泡24h，用蒸餾水洗滌，抽濾，將制備的殼聚糖微球放置于裝有100mL pH為10的NaOH溶液燒杯中，加入0.5mL的乙酸乙酯和0.5mL環氧氯丙烷，在60℃磁力攪拌6h，將交聯后的殼聚糖微球用大量蒸餾水洗滌去除未反應的環氧氯丙烷，40℃下真空干燥10h，備用[13]。

1.2.3 以殼聚糖微球為載體的印跡聚合物的制備 在150mL具塞的三頸瓶中加入1mmol（0.263g）喹乙醇，6mL水和4mL乙腈，加熱回流溶解；加入2mmol（0.142g）丙烯酰胺，磁力攪拌30min，加入0.500g改性殼聚糖微球攪拌10min，加入亞甲基雙丙烯酰胺4mmol（即0.616g）攪拌30min，加入0.400g過硫酸鉀（KPS）攪拌20min，充氮氣15min，放入58℃水浴鍋內靜置24h，抽濾，用去離子水和甲醇先后洗滌，置100℃下真空干燥10h。

將聚合物放入100mL的具塞圓底燒瓶中，加入50mL甲醇和15mL 1mol·L-1鹽酸，磁力攪拌4h，過濾，用0.1mol·L-1氫氧化鈉、熱水先后洗滌至中性，在80℃下真空干燥10h。然后將聚合物置于索氏萃取器中，用150mL甲醇和冰乙酸（9∶1，v/v），連續萃取24h洗至無喹乙醇檢出，用甲醇和蒸餾水洗到中性，100℃下真空干燥10h。

制備非分子印跡聚合物（NIP）除不加模板分子喹乙醇，其余操作步驟同上述分子印跡聚合物（MIP）的制備[14]。

1.2.4 傅立葉紅外光譜分析 采用KBr壓片法制樣，掃描范圍為400～4000cm-1，對喹乙醇及喹乙醇印跡聚合物（除去模板分子）和非印跡聚合物進行紅外光譜分析。

1.2.5 掃描電鏡分析 為了研究合成的分子印跡聚合物的表面結構特性，對印跡聚合物和非印跡聚合物進行掃描電鏡分析，將聚合物在IB-5離子濺射儀中鍍鉑，用SS-35掃描電鏡觀察并拍照。

1.2.6 吸附平衡結合實驗 準確稱取20.0mg分子印跡聚合物于50mL的棕色容量瓶中，加入10mL喹乙醇標準溶液，振蕩4h，4000r/min離心20min。準確移取上清液1.0mL稀釋至5.0mL，在紫外-可見光度計上測定其吸光度，測定波長為372nm。同時平行做非分子印跡聚合物對喹乙醇的平衡結合實驗。

根據聚合物平衡吸附后測定的吸光度值和喹乙醇標準曲線，求得在平衡吸附后溶液濃度（Ce），根據吸附前后溶液濃度的改變計算吸附容量Q（mg·g-1）[15]。

Q=（Co-Ce）V/W 式（1）

式中，Co為原始濃度（mg/mL），Ce為吸附后溶液濃度（mg/mL），V為溶液體積（mL），W為樣品用量（g）。1.2.7 吸附動力學實驗 準確稱取20.0mg分子印跡聚合物于50mL的棕色容量瓶中，加入100mg·L-1的喹乙醇溶液10mL，在室溫下振蕩5、30、60、120、180、240min，4000r/min離心20min。準確移取上清液1.0mL稀釋至5.0mL，在紫外-可見光度計上測定上清液的吸光度，測定波長為372nm。

1.2.8 選擇吸附性實驗 分別稱取20.0mg分子印跡聚合物于50mL的棕色容量瓶中，加入10mL 100mg·L-1喹乙醇標準溶液，10mL 100mg·L-1乙酰甲喹標準溶液以及10mL 100mg·L-1喹烯酮標準溶液，振蕩4h，4000r/min離心20min。準確移取上清液1.0mL稀釋至5.0mL，在紫外-可見光度計上測定其吸光度，測定波長為372、372、314nm。

分離因子（α）=QMIP/QNIP式（2）

靜態吸附分配系數KD定義為：KD=CP/Cs 式（3）

式中，Cp表示底物在聚合物上的濃度（mg·L-1），Cs表示底物在溶液中的濃度（mg·L-1）。

分離因子α又可以定義為：

α=KDi/KDj式（4）

式中，i和j表示模板分子和底物，規定j=i時，α=1.0

印跡效率因子（β）=α/α’ 式（5）

式中，α’表示喹乙醇的結構類似物乙酰甲喹或喹烯酮的分離因子。

2 結果與討論

2.1 喹乙醇標準曲線的繪制

圖1 喹乙醇標準曲線的繪制Fig.1 Standard curve olaquindox

通過全波長掃描，確定372nm為喹乙醇的最大吸收波長。標準曲線如圖1所示，R2為0.997，具有較好的線性關系。

2.2 以殼聚糖為載體分子印跡聚合物的制備影響因素

2.2.1 功能單體和交聯劑的選擇 由表1的結果可以得知，功能單體為丙烯酰胺，交聯劑為MBA時吸附容量最高。在親水性分子印跡聚合物的制備中，常選用的交聯劑MBA，此交聯劑常與功能單體丙烯酰胺一起作用，形成聚丙烯酰胺凝膠，該凝膠具有良好生物兼容性，并有柔軟的大孔結構，可方便模板分子進出等優點，但是聚丙烯酰胺凝膠過于柔軟，沒有剛性結構，以殼聚糖微球為載體制備分子印跡聚合物則克服了凝膠固有的缺點，提高了其作為聚合物高吸附容量的優勢。

表1 不同功能單體和交聯劑組成Table 1 Various consistute of the functional monomer and cross-linker investigated for the preparation

2.2.2 功能單體和交聯劑的配比優化 表2結果表明：將1mmol（0.263g）喹乙醇溶解在4mL水和6mL乙腈中，充分溶解后加入2mmol（0.142g）丙烯酰胺，磁力攪拌30min，再加入0.5g改性殼聚糖微球攪拌10min，最后加入亞甲基雙丙烯酰胺4mmol（即0.616g）和引發劑所合成的材料對喹乙醇的吸附效果最佳，即MIP8，因此聚合物的性能表征實驗均以MIP8及其空白聚合物進行。

圖2 紅處光譜圖Fig.2 Infrared spectrogram

表2 不同功能單體和交聯劑配比Table 2 Various ratios of the functional monomer and cross-linker investigated for the preparation of the olaquidox MIPs

2.3 殼聚糖為載體分子印跡聚合物的表征

2.3.1 傅立葉紅外光譜分析 圖2（A）中改性殼聚糖紅外光譜圖中基本上保留了殼聚糖原有的特征吸收峰形，在1561cm-1和1416cm-1處峰形的消失，說明殼聚糖的氨基和羥基參與了交聯反應。從圖2（B）中可以看到，在3434cm-1處有吸收峰出現，在此頻率出現的吸收峰是胺和酰胺的N-H伸縮振動，1658cm-1是C=O的振動頻率，酰胺基里C=O由于氨基的影響，使得C=O伸縮振動向低波數位移，另外，酰胺基的C-N鍵在1300～1260cm-1里出現，由于聚合反應的影響，C＝C的伸縮振動頻率在1531cm-1附近。由圖譜可知，喹乙醇分子與功能單體成功發生反應，圖2（C）是非印跡聚合物紅外光譜圖，從譜圖中可以看到印跡聚合物和非印跡聚合物有相似的圖譜，說明模板喹乙醇已從印跡聚合物里洗脫出來。

2.3.2 掃描電鏡分析 由圖3（A）列可以看出，殼聚糖經適量改性后，其表面不再光滑，但經1000倍放大后觀察可見其表面有較多的褶皺，可能是其具有較好的吸附性能的原因；圖3（B1）是分子印跡聚合物的外部形貌，可以看到聚合物呈球形，表面覆蓋一層聚合膜，從圖3（B2）中可以看到聚合物表面有許多細小均勻的孔穴，有可能是洗脫模板喹乙醇后留下的孔穴；圖3（C）列是非印跡聚合物的電鏡圖，從圖3（C1）可以看到聚合物表面較光滑，且有許多裂縫，圖3（C2）中可以看到表面也有許多孔隙，但大小不均，可能是洗脫過程中萃取劑隨機對聚合物洗脫，從而留下不規則的孔穴。

圖3 掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron micrographs

2.3.3 平衡結合實驗 由圖4可以看出，隨喹乙醇標液濃度逐漸增大，分子印跡聚合物和非印跡聚合物對其吸附量逐漸增大，非印跡聚合物對100mg·L-1濃度的喹乙醇吸附容量為5.93mg·g-1，而印跡聚合物吸附容量為10.14mg·g-1，在相同條件下，印跡聚合物對模板分子的吸附容量明顯高于非印跡聚合物，說明印跡聚合物對喹乙醇具有較好的選擇性吸附。制備的聚合物對喹乙醇具有選擇性吸附的原因可能是因為在殼聚糖表面制備的聚合物內部形成了與喹乙醇的官能團位置與形狀相適宜的空腔，從而使得聚合物對模板分子具有良好的選擇性結合能力。

2.3.4 吸附動力學 圖5是分子印跡聚合物的吸附動力學曲線，從圖5中可以看到，分子印跡聚合物對喹乙醇的吸附容量隨時間的延長而逐漸增加，在60min的吸附容量為5.89mg·g-1，占最大吸附容量的57.6%，吸附大約在3h后達到平衡。說明分子印跡聚合物具有較好的吸附動力學，因為分子印跡聚合物在殼聚糖表面合成，所以模板分子進入聚合物內部與其形狀和結合基團相配合的孔穴需要較短的時間，從而具有較快的吸附速度。

2.3.5 選擇吸附性 表3比較了以殼聚糖為載體的分子印跡聚合物和非印跡聚合物對喹乙醇、喹烯酮和乙酰甲喹的吸附容量、靜態吸附分離因子α和印跡效率因子β。

圖4 分子印跡聚合物及非分子印跡聚合物的吸附等溫線Fig.4 Adsorption isotherms of the molecularly imprinted polymers and non-molecular imprinted polymer

圖5 分子印跡聚合物的吸附動力學曲線Fig.5 Kinetics uptake plot of the MIP toward olaquindox

表3 印跡聚合物和非印跡聚合物對喹乙醇、喹烯酮和乙酰甲喹的選擇吸附性Table 3 The selectivity for olaquindoxs，quinocetone，mequindox by MIP and NIP

從表3中可知，以殼聚糖為載體的分子印跡聚合物對喹乙醇的吸附容量為10.14mg·g-1，遠遠高于喹烯酮和乙酰甲喹，表明印跡聚合物對模板分子喹乙醇主要是特異性吸附。另外，印跡聚合物對兩種類似物喹烯酮和乙酰甲喹的印跡效率因子很大（2.0及以上），說明印跡聚合物對喹乙醇具有顯著的印跡效應，對其他兩種類似物的識別能力和選擇性較差。這些結果進一步表明，在分子印跡聚合物中存在固定排列的結合基團的立體空腔，空腔的大小與空腔內結合基團的位置和模板分子相適宜，從而對模板分子有“記憶”功能，因此對模板分子有特異的選擇性。

3 結論

本研究以殼聚糖為載體，運用表面印跡-溶膠凝膠法制備喹乙醇分子印跡聚合物。制備的印跡聚合物對100mg·L-1濃度的喹乙醇吸附容量為10.14mg·g-1，而非印跡聚合物的吸附容量僅為5.93mg·g-1，說明其具有較高的吸附容量；制備的印跡聚合物在60min的吸附容量為5.89mg·g-1，占最大吸附容量的57.6%，吸附大約在3h后達到平衡，表明具有較快的吸附速度；對喹烯酮的印跡效率因子達2.29，對乙酰甲喹的印跡效率因子為2.22，表明制備的印跡聚合物具有較好的選擇吸附性。因此，所合成的功能材料適用于對喹乙醇的檢測。

[1]趙從民．喹乙醇的作用與使用方法[J]．吉林畜牧獸醫，2003（11）：41．

[2]鄧云波，段蘇華，陳啟友．喹乙醇的特性及其規范合理使用[J]．湖南畜牧獸醫，2004（1）：14-17．

[3]宋春美，侯玉澤，劉宣兵，等．喹乙醇的危害及檢測方法研究進展[J]．河南農業科學，2009（12）：13-17．

[4]羅楊，張劍勇.高效液相色譜法測定飼料中喹乙醇含量[J].中國飼料，2006（12）：35-38.

[5]Thente K，Andersson B.The determination of olaquindox in pig feeds by high-peformance liquid chromatography[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，1982，33（10）：945-948.

[6]Poucke C V，Dumoulin F，Peteghem C V.Detection of banned antibacterialgrowth promoters in animalfeed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry：optimization of the extraction solvent by experimental design[J].Analytica Chimica Acta，2005，529（1-2）：211-220.

[7]曾靜，朱寬正.高效液相色譜-串聯質譜法檢測水產品中的喹乙醇[J].中國食品衛生雜志，2006，18（5）：423-425.

[8]楊文軍，張麗英.高效液相色譜質譜聯用法測定飼料中喹乙醇[J].中國飼料，2006（20）：33-36.

[9]冀寶慶.喹乙醇及其代謝殘留免疫檢測技術研究[D].無錫：江南大學，2008.

[10]Zhao D，He L，Pu C，et al.A highly sensitive and specific ployclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibiotic olaquindox in animal feed samples[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2008，39（1）：2653-2661.

[11]姜忠義．分子印跡聚合物的設計與制備[J]．高分子材料科學與工程，2004，20（3）：25-28.

[12]王華芳，何運華，何錫文，等．3-氨基苯硼酸為功能單體在殼聚糖上印跡牛血清白蛋白的研究[J]．高等學校化學學報，2008，29（4）：726-730.

[13]楊春梅，顧磊，孫怡，等．離子交聯法制備氟尿嘧啶殼聚糖微球[J]．華東理工大學學報：自然科學版，2010，36（4）：546-549.

[14]Guo T Y，XiaY Q，Wang J，et al.Chitosan beads as molecularly imprinted polymer matrix for selective separation of proteins[J]. Biomaterials，2006，26（28）：5737-5745

[15]Cormack P，Mosbach K.Molecular imprinting：recent developments and the road ahead[J].Reactive and Functional Polymers，1999，41（1-3）：115-124.

Preparation and characterization of olaquindox molecularly imprinted polymer using the modified chitosan carrier

ZHAO Dong-yan1，QIAO Xu-guang2，*，XU Zhi-xiang2，AN Yan-dong2
（1.Department of Biological and Food，Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315100，China；2.Department of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai’an 271000，China）

A simple molecularly imprinted polymer（MIP）was prepared using olaquindox as the imprinted molecule，acrylamide as the functional monomer，and N，N’-Methylenebisacrylamide as the cross-linker，chitosan as matrix in the mixed solvent of doubly deionized water（DDW）and acetonitrile.This prepared material was evaluated by FT-IR spectra，SEM images，uptake kinetics experiments，static adsorption experiments and selective adsorption experiments.The results indicated that the adsorption capacity of the imprinted polymer were 10.14mg·g-1.The imprinting efficiency factor to quinocetone was 2.29，the imprinting efficiency factor to mequindox was 2.22.The MIP had much higher adsorption capacity and also had a faster adsorption capacity for the olaquindox.

chitosan；olaquindox；molecularly imprinted polymer；characterization

TS207.3

A

1002-0306（2014）12-0108-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.014

2013－10－28 *通訊聯系人

趙冬艷（1976-）女，博士，講師，研究方向：食品安全檢測。

國家自然科學基金面上項目（31171699）；山東省教育廳科技計劃項目（J11LC29）。