屎腸球菌發(fā)酵特性及其功能性研究

夏 玉，鄭 華，林 捷，徐國波（華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642）

屎腸球菌發(fā)酵特性及其功能性研究

夏 玉，鄭 華，林 捷*，徐國波
（華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642）

探討了分離自新疆酸奶疙瘩的一株屎腸球菌在乳制品應用中具有的潛在益生價值。通過測定滴定酸度、丁二酮、乙醛、游離氨基酸等指標，研究了屎腸球菌在脫脂乳中的發(fā)酵特性以及發(fā)酵乳上清液具有的抗氧化與抑菌功能。結(jié)果表明，屎腸球菌產(chǎn)酸、產(chǎn)香和降解酪蛋白能力強，37℃發(fā)酵24h，滴定酸度為123.55°T，丁二酮含量為12.31μg/mL，乙醛含量高達90.12μg/mL，游離氨基酸含量為331.92μg/mL，活菌數(shù)最高可達1.10×1010cfu/mL。發(fā)酵乳上清液對常見病原微生物有抑制作用，且抑菌物質(zhì)具有熱穩(wěn)定性、較寬的pH范圍、對蛋白酶敏感的特點，對羥自由基清除率為96.84%，超氧陰離子自由基清除率為31.33%，具有抗氧化能力。

屎腸球菌，發(fā)酵特性，抑菌，抗氧化

腸道益生菌是一類活的微生物，可幫助機體消化和抑制有害微生物的生長，有益于宿主的健康。屎腸球菌是腸道內(nèi)的正常菌群，廣泛存在于傳統(tǒng)乳制品中，具有耐酸、耐熱、腸道粘附能力強等特點，以及抑制病原菌、增強免疫力等作用[1-2]。研究表明，在乳制品中投放乳品株腸球菌對于傳統(tǒng)奶酪成熟和香氣的形成具有積極作用，通過蛋白水解與脂分解，檸檬酸鹽代謝，產(chǎn)生芳香性揮發(fā)化合物[3]。腸道病原菌以及體內(nèi)自由基失衡能夠引發(fā)多種疾病，水解乳蛋白制備具有功能性的活性多肽已有諸多報道[4]，有研究表明屎腸球菌具有抗氧化作用[5]以及在代謝過程中能產(chǎn)生有機酸、細菌素等物質(zhì)，對腸道中病原菌如大腸桿菌、沙門氏菌等生長有抑制作用[6]，但是，以屎腸球菌發(fā)酵脫脂乳具有的抑菌、抗氧化活性研究不多。

目前，屎腸球菌主要應用在飼料、畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，乳制品方面應用較少。通過探究從新疆酸奶疙瘩中分離出來的屎腸球菌在脫脂乳中的發(fā)酵特性，以及發(fā)酵乳具有的益生功能，為屎腸球菌的進一步研究和在乳制品中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

屎腸球菌（Enterococcus faecium） 實驗室保存菌種，分離自新疆酸奶疙瘩；保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合菌種（Lactobacillus bulgaricus and Streptococcus thermophilus，簡稱混合菌） 購于科漢森有限公司；大腸桿菌（Escherichia Coli）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、腸鏈球菌（Intestinal Streptococcus） 實驗室保存菌種；脫脂奶粉 新西蘭進口；胰蛋白酶PTN6.0S（7.05×104U/g） 廣州明遠工貿(mào)有限公司；丁二酮、三氯乙酸、碘、碘化鉀 均為分析純。

AL104型電子分析天平 深圳市衡通偉業(yè)科技儀器有限公司；DL-5型低速大容量離心機 上海優(yōu)浦科學儀器有限公司；UVmin-1240型分光光度計 島津儀器有限公司；pHs-2F型pH計 上海精科；AHYQHH-1型恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；SNB-1型粘度計 上海方瑞儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 脫脂乳培養(yǎng)基：10g脫脂乳粉溶于100mL蒸餾水，配成復原乳后，115℃、滅菌15min。

營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，NaCl 5g，蒸餾水1L，pH7.2，121℃、滅菌15min。

1.2.2 發(fā)酵乳的制備 屎腸球菌凍干菌粉在脫脂乳培養(yǎng)基活化后，以4%的接種量接入經(jīng)95℃，5min滅菌的脫脂乳中，混勻至菌濃度106cfu/mL，37℃恒溫培養(yǎng)，每隔3h取樣測定相關(guān)指標。保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌以1∶1比例混合發(fā)酵脫脂乳作為對照。

1.2.3 屎腸球菌發(fā)酵脫脂乳指標測定 pH測定采用精密pH計；粘度測定采用SNB-1粘度計；滴定酸度測定參照《GB/T 13663-2008》；活菌數(shù)測定參照《GB/T 4789.35-2010》；乙醛含量參考文獻[7]中方法測定；丁二酮含量參考文獻[8]中方法測定；蛋白水解能力參考文獻[9]中方法測定。

1.2.4 發(fā)酵乳抑菌測試 大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、腸鏈球菌為指示菌，指示菌用NB培養(yǎng)基活化，調(diào)整活菌數(shù)為107cfu/mL。屎腸球菌發(fā)酵乳4000r/min，離心10min，取上清液，冷凍濃縮為原來體積的四分之一，備用。用1mol/L的HCl或者NaOH，將發(fā)酵上清液調(diào)節(jié)pH為4、5、6、7、9、11，進行抑菌實驗；發(fā)酵上清液在60、80、100℃溫度下處理20min，進行抑菌實驗；加入量為1mg/mL胰蛋白酶，調(diào)節(jié)pH為7，37℃水解1.5h，水解結(jié)束后pH調(diào)回6.5，以水解液進行抑菌。對照為發(fā)酵乳原液，采用牛津杯擴散法[10]進行測定。

1.2.5 發(fā)酵乳抗氧化能力測試 屎腸球菌發(fā)酵乳4000r/min，離心15min，去除活菌和大分子蛋白，取上清液及4℃冷藏12h上清液為樣品。以VC作為對照。發(fā)酵乳上清液對羥自由基清除能力參考文獻[11]中的方法進行測定；發(fā)酵乳上清液對超氧陰離子自由基清除能力參考文獻[12]中的方法測定；發(fā)酵乳上清液總還原能力參考文獻[13]中的方法進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 屎腸球菌發(fā)酵乳中酸度與pH的變化

滴定酸度反應了包括肽段和游離氨基酸殘基在內(nèi)的所有酸性基團的總和，pH反映游離氫離子濃度。其中乳酸是乳酸菌的主要代謝產(chǎn)物，是酸度上升的重要因素，它可以賦予發(fā)酵乳清爽的酸味。如圖1、圖2所示，屎腸球菌發(fā)酵脫脂乳，pH下降較快，滴定酸度增長較快。發(fā)酵9h后，酸度為85.35°T，高于傳統(tǒng)發(fā)酵乳的75.11°T；pH為3.98，低于傳統(tǒng)發(fā)酵乳的4.17；且pH最終可以達到3.45；酸度123.55°T。表明屎腸球菌具有較強的產(chǎn)酸性能和乳糖降解能力。

圖1 不同菌株在發(fā)酵過程中pH變化Fig.1 Changes of pH of different strains in fermentation process

圖2 不同菌株在發(fā)酵過程中滴定酸度變化Fig.2 Changes of titratable acidity of different strains in fermentation process

2.2 屎腸球菌發(fā)酵乳中活菌數(shù)與粘度的變化

屎腸球菌經(jīng)脫脂乳活化后，在脫脂乳中增長速度很快，18h后進入了穩(wěn)定期，活菌數(shù)達到峰值1.10× 1010cfu/mL，18h后，活菌數(shù)略有下降（見圖3）。

圖3 不同菌株在發(fā)酵過程中活菌數(shù)變化Fig.3 Changes of viable cell counts of different strains in fermentation process

屎腸球菌發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間延長，粘度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（見圖4）。粘度反映發(fā)酵乳形成凝乳的過程，酪蛋白顆粒間的靜電作用導致粘度的上升，脫脂乳中缺少脂肪，凝乳時組織狀態(tài)較松散，并未明顯出現(xiàn)粘度的突增點，隨后的發(fā)酵過程中，粘度進一步升高，發(fā)酵15h，粘度值為929mPa·s顯著低于傳統(tǒng)酸奶6h時1734.13mPa·s。可能與對數(shù)期菌代謝產(chǎn)生的胞外多糖有關(guān)，胞外多糖可以使發(fā)酵乳具有良好的拉絲性或比較黏稠的質(zhì)地[14]。發(fā)酵后期，由于有部分乳清析出，粘度下降。

圖4 不同菌株在發(fā)酵過程中粘度變化Fig.4 Changes of viscosity of different strains in fermentation process

2.3 屎腸球菌發(fā)酵乳中丁二酮與乙醛的變化

丁二酮是酮香型發(fā)酵乳的主要風味物質(zhì)，通過檸檬酸代謝途徑產(chǎn)生，α-乙酰乳酸被氧化形成丁二酮，乙醛由乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的氨基酸、核酸及丙酮酸代謝產(chǎn)生[15]，是發(fā)酵乳的基本風味物質(zhì)。屎腸球菌發(fā)酵過程中丁二酮含量先上升后趨于穩(wěn)定，發(fā)酵6h，丁二酮含量為3.07μg/mL，與傳統(tǒng)混合菌產(chǎn)量3.96μg/mL相當，發(fā)酵18h達12.08μg/mL。發(fā)酵初期，大部分檸檬酸用于進行三羧酸循環(huán)，丁二酮的積累較慢。繼續(xù)發(fā)酵，丁二酮含量快速上升，與丁二酮形成的最適pH4.3～4.8相關(guān)。發(fā)酵后期，由于菌種代謝活力較低和丁二酮的集聚，丁二酮含量保持在相對高且穩(wěn)定的狀態(tài)（圖5）。

圖5 不同菌株發(fā)酵過程中丁二酮含量變化Fig.5 Changes of diacetyl of different strains in fermentation process

圖6 不同菌株發(fā)酵過程中乙醛含量變化Fig.6 Changes of acetaldehyde of different strains in fermentation process

在發(fā)酵過程中，乙醛生成酶的活性大于乙醇轉(zhuǎn)化酶時，乙醛才能積累。如圖6所示，屎腸球菌發(fā)酵過程中，乙醛含量總體趨勢是隨時間延長而增長的。發(fā)酵6h，乙醛含量為16.74μg/mL，高于傳統(tǒng)混合菌12.28μg/mL。在12～18h間，隨著時間延長呈直線增長的趨勢（p＜0.05），在24h含量高達90.12μg/mL，遠高于文獻報道，在單一乳酸菌發(fā)酵的發(fā)酵乳中，主要羰基化合物乙醛含量2.0～41.0μg/mL[16]，表明屎腸球菌具有強的產(chǎn)香特性。

2.4 屎腸球菌的蛋白水解活力變化

屎腸球菌在繁殖過程中分泌蛋白酶和肽酶，可以降解酪蛋白和肽，產(chǎn)生豐富的小分子肽和氨基酸，適度的蛋白水解對改善制品風味以及生成活性多肽，具有重要作用。由圖7可知，游離氨基酸的含量總體呈現(xiàn)曲折增長的趨勢（p＜0.05）。發(fā)酵24h，含量為331.92μg/mL，遠高于傳統(tǒng)混合菌產(chǎn)生量192.4μg/mL。與呂加平[17]研究相比，同樣的測定方法，產(chǎn)生的游離氨基酸，瑞士乳桿菌為439.54μg/mL，干酪乳桿菌為85.51μg/mL。屎腸球菌具有良好的蛋白水解能力，感官評定無異常風味產(chǎn)生。

圖7 不同菌株在發(fā)酵過程中游離氨基酸變化Fig.7 Changes of free amino acids of different strains in fermentation process

2.5 屎腸球菌發(fā)酵乳抑菌特性研究

屎腸球菌發(fā)酵乳原液對常見致病菌均有抑制作用（結(jié)果見表1）。酸性條件下，發(fā)酵上清液的抑菌效果較好，堿性條件下抑菌能力消失，抑菌物質(zhì)可能是乳酸，或是在酸性條件下起作用的某些物質(zhì)。發(fā)酵上清液經(jīng)過100℃、20min熱處理后，對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌仍有抑制作用，表明抑菌物質(zhì)具有一定的熱穩(wěn)定性。經(jīng)胰蛋白酶處理后，發(fā)酵上清液液對大腸桿菌、腸鏈球菌均無抑制作用，對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌抑菌能力減弱，說明抑菌物質(zhì)對蛋白酶具有敏感性。該結(jié)論與Simova[10]，Rehaiem等[18]的研究結(jié)果相似，從乳制品中分離的屎腸球菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的細菌素，能耐受pH2～10，具有熱穩(wěn)定性及對蛋白酶的敏感性。

2.6 屎腸球菌發(fā)酵乳抗氧化指標的測定

人體內(nèi)代謝產(chǎn)生的自由基與衰老、癌癥、動脈硬化等疾病有關(guān)，羥自由基是目前所有活性氧中對生物體毒性最強、危害最大的一種自由基，O2-·的形成是氧毒性的主要因素[19]，可以引起膜損傷，外源性抗氧化劑可以幫助人體維持體內(nèi)自由基平衡。

表1 發(fā)酵乳上清液抑菌結(jié)果（n=4）Table 1 The antibacterial properties of fermented milk supernatant（n=4）

表2 發(fā)酵乳上清液抗氧化結(jié)果（n=3）Table 2 The results of antioxidant activities of fermented milk supernatant（n=3）

結(jié)果見表2，屎腸球菌發(fā)酵乳具備一定的抗氧化能力，常溫下羥自由基清除率達96.84%，冷藏12h，抗氧化能力略有下降，但仍遠高于對照組0.2mg/mL VC的清除率；超氧陰離子清除能力和總還原能力顯著低于對照組VC。抗氧化機理現(xiàn)在沒有統(tǒng)一定論，但蛋白水解過程中產(chǎn)生的抗氧化肽對抗氧化活性有積極作用[20]，發(fā)酵乳抗氧化功能對增強乳酸菌抵抗含氧化合物的毒性，幫助乳酸菌群在腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)中自我防御有重大意義。

3 結(jié)論

屎腸球菌發(fā)酵脫脂乳相比對照組保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合菌具有更好的產(chǎn)酸、產(chǎn)香能力、蛋白水解能力等發(fā)酵特性。屎腸球菌在脫脂乳中經(jīng)過37℃發(fā)酵24h時，滴定酸度為123.55°T，丁二酮含量為12.31μg/mL，乙醛含量高達90.12μg/mL，均顯著升高，并且產(chǎn)生游離氨基酸含量為331.92μg/mL，遠高于混合菌產(chǎn)生量192.4μg/mL。而且，屎腸球菌發(fā)酵乳香味純正，有屎腸球菌產(chǎn)生的特殊風味。

屎腸球菌發(fā)酵乳上清液具備一定的羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力與還原能力，顯示了抗氧化活性。發(fā)酵乳對大腸桿菌、沙門氏菌、腸鏈球菌、金黃色葡萄球均有抑制效果，且抑菌物質(zhì)經(jīng)過不同溫度、pH、酶處理后，對沙門氏菌與金黃色葡萄球菌仍有良好抑制作用。

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Study on the fermentation and function characteristics of Enterococcus Faecium

XIA Yu，ZHENG Hua，LIN Jie*，XU Guo-bo
（College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

The potential application in dairy products of Enterococcus faecium selected from Xinjiang yogurt bumps was discussed.The fermentation characteristics of Enterococcus faecium in the skin milk and the antioxidative and antibacterial activity of fermentation liquid were studied via the determination on titration acidity，diacetyl，acetaldehyde，free amino and so on.The results showed that Enterococcus faecium demonstrated strong acid production，aroma-producing and proteolytic activity，the titration acidity was 123.55°T，the characteristic flavor contained 12.31μg/mL of diacetyl，90.12μg/mL of acetaldehyde，the free amino acids content was 331.92μg/mL and the living cells was up to 1.10×1010cfu/mL after incubation for 24 hours at 37℃.Fermented liquid showed inhibitory activity against pathogenic microorganisms and antimicrobial substances were resistant to heating，stable at a wide pH range，sensitive to protease.The scavenging activity on hydroxyl radical and superoxide radical anion of fermented milk were 96.84%，31.33%.

Enterococcus faecium；fermentation characteristics；inhibitory activity；antioxidant

TS201.3

A

1002-0306（2014）12-0123-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.017

2013－09－16 *通訊聯(lián)系人

夏玉（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品加工、保藏與包裝。

廣東省科技攻關(guān)項目（2012B010300019）。