溶劑類型對紅皮云杉球果多酚類物質的提取及抗氧化能力的影響

鄭洪亮，王 萍，高新新，位 珍，王振宇，2，*（.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱50040；2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱50086）

溶劑類型對紅皮云杉球果多酚類物質的提取及抗氧化能力的影響

鄭洪亮1，王 萍1，高新新1，位 珍1，王振宇1，2，*
（1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150086）

利用不同溶劑提取紅皮云杉球果中多酚類化合物并測定了三種酚類化合物（總多酚，黃酮和原花青素）的含量和提取物的抗氧化性能力（清除DPPH自由基，清除羥基自由基和還原力）。結果表明，提取溶劑的差異對紅皮云杉球果提取物總多酚，黃酮，原花青素含量和抗氧化活性影響顯著。紅皮云杉球果中含有較高含量的多酚（88.90± 1.37）mg/g、原花青素（74.26±0.74）mg/g，和相對較低含量的黃酮類化合物（47.80±0.86）mg/g。原花青素是紅皮云杉球果提取物中重要的組成部分，并在紅皮云杉球果提取物的抗氧化能力中起到了重要作用。實驗中鑒定出的含量較高的綠原酸和兒茶素可以極大地促進了提取物的抗氧化活性。

紅皮云杉，松多酚，抗氧化，原花青素

合成抗氧化劑由于具有潛在的致癌性，其使用逐漸受到限制。植物中含有豐富的天然活性抗氧化劑，包括維生素，生物堿，酚類化合物和黃酮類化合物[1]。尋找植物來源的天然抗氧化劑成為了目前的趨勢。消費者更關注依賴于天然防腐劑從而獲得健康的生活方式和營養素[2]。據研究表明，植物成分的抗氧化作用主要歸因于多酚類化合物，如黃酮類、酚酸類物質、原花青素和酚類二萜[3]。多酚類物質具有消炎、抗過敏、抗菌、抗致癌和抗病毒的作用[4]，在人類健康中發揮了重要作用。在植物中，這些化合物的抗氧化能力可以防止脂質過氧化和低密度脂蛋白的氧化修飾。

紅皮云杉主要應用以其為原料的紙漿工業和建筑業，但球果不能被充分利用，并且關于紅皮云杉的化學成分和生物活性的研究很少，特別是對紅皮云杉球果中的酚類化合物沒有深入的研究報道。由于酚類化合物具有較強的抗氧化能力[5]，大量的提取方法被用來從植物材料提取多酚類物質，包括超臨界流體萃取[6]，索氏提取和加壓低極性水萃取[7]。然而，提取酚類化合物最常用的方法是利用有機溶劑或含水有機溶劑與植物材料混合一段時間內，以保證完全提取[8]。常用提取酚類化合物的溶劑包括丙酮[9]，乙醇[10]，乙酸乙酯[11]，己烷[12]，甲醇[13]等。

本研究利用正丁醇（100%），乙酸乙酯（100%），蒸餾水，丙酮（20%、40%、60%、80%、100%），乙醇（20%、40%、60%、80%、100%）13種不同極性的溶劑從紅皮云杉球果粉末中提取酚類化合物，并測定各種溶劑提取物中三種酚類化合物（總酚，黃酮和原花青素）含量和提取物的抗氧化活性（清除DPPH自由基、清除羥自由基和還原能力），利用RP-HPLC法初步分析鑒定紅皮云杉球果提取物。為后續研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅皮云杉球果 黑龍江省葦河林業局，采集時間為（2011年）9月份，將球果鱗片（去掉中間木質軸）低溫干燥后粉碎過80目篩后-20℃密封冷凍，備用；DPPH（2，2-二苯基-1-苦基肼）、2-脫氧-D-核糖、Trolox、沒食子酸 均購自Sigma公司；乙酸乙酯、正丁醇、丙酮和乙醇、碳酸鈉、福林酚試劑（FC）、鹽酸、氮藍四唑、磷酸氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鐵（III）六水合物、乙二胺四乙酸二鈉鹽、過氧化氫、抗壞血酸、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸（TBA）、乙二胺四乙酸、FRAP試劑、乙醇 均為分析純；蒸餾水。

SHB－3型循環水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；RE－52A型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；TDL－40B－W型臺式低速大容量離心機 湖南星科科學儀器有限公司；KQ－500DE型數控超聲波清洗機 昆山市超聲波儀器有限公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司，包括四元泵、自動進樣器、柱溫箱、VWD檢測器檢測器、DAD二極管陣列檢測器和在線脫氣機、Sino Chrom ODSBP反向色譜柱（5μm、4.6mm×150mm）。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅皮云杉球果粗提物的制備 準確稱量2.000g的紅皮云杉球果粉末于250mL錐形瓶中用來提取粗多酚。用N-正丁醇，醋酸乙酯，用蒸餾水，丙酮（20%、40%、60%、80%），丙酮，乙醇（20%、40%、60%、80%）和乙醇做提取劑，以料液比1∶30（mg/mL），溫度50℃提取3h。提取得到的混合物在4000r/min離心20min，收集上清液，殘渣用相應的試劑提取直到上清液顏色接近無色。收集所有上清液40℃條件下旋轉蒸發出去乙醇獲得多酚粗提物，4℃儲藏于棕色瓶中待用。

1.2.2 多酚含量的測定 多酚的測定方法采用福林酚比色法，參考自Dewanto[14]。建立沒食子酸標準曲線y=4.4076x-0.0014（R2=0.9983）。

1.2.3 黃酮含量的測定 黃酮含量的測定方法參考Dewanto[14]。通過兒茶素標準曲線，以兒茶素當量值表示總黃酮含量，兒茶素標準曲線是y=1.1325x-0.0056，（R2=0.9989）。

1.2.4 原花青素含量測定 原花青素的含量的測定采用香草醛法[15]略改。1mL樣液中加入2.5mL 4%的香草醛-甲醇溶液和2.5mL 30%的硫酸-甲醇溶液，混勻后37℃避光15min，510nm處測定混合物吸光值。通過兒茶素標準曲線，以兒茶素當量值表示原花青素含量，兒茶素標準曲線是y=2.0437x+0.0078，（R2= 0.9993）。

1.2.5 清除DPPH自由基能力 精確吸取1.000mL的紅皮云杉球果多酚提取物溶液（10～250μg/mL），之后加入4.0mL 1×10-4mol/L DPPH溶液（用無水乙醇配制），搖勻后37℃避光反應30min，后于517nm處測定吸光值，用Trolox作陽性對照，同時做平行實驗。清除率計算公式如下：

RSA（%）＝[A3-（A1-A2）]/A3×100

式中：A1為紅皮云杉球果提取物、Trolox加DPPH溶液；A2為紅皮云杉球果提取物或Trolox加無水乙醇；A3為與紅皮云杉球果提取物或Trolox等量蒸餾水加DPPH溶液。

1.2.6 清除羥基自由基能力 對羥基自由基的清除作用采用生成硫代巴比妥酸法來測定，用2-脫氧-D-核糖作底物，這個方法來自于Hsu[16]。清除率計算公式如下：

RSA（%）＝[A3-（A1-A2）]/A3×100

式中：A1為紅皮云杉球果提取物、Trolox加所有試劑；A2為紅皮云杉球果提取物、Trolox加除2-脫氧-D-核糖以外的所有試劑；A3為蒸餾水或者無水乙醇加所有試劑。

1.2.7 鐵離子還原能力（FRAP法） 鐵離子還原能力測定方法參見文獻[17]。

1.2.8 多酚類物質的高效液相色譜初步分析 20mL 60%丙酮（BHT（1g/l））中加入0.500g樣品干物質，然后加入10mL 1mol/L的HCl，混勻后離心15min，90℃回流2h，混合物過0.45μm濾膜后吸取5μL注入高效液相色譜分析儀中。洗脫程序為0～11min，95A/5B～ 85A/15B；11～16min，85A/15B～83A/17B；16～23min，83A/17B～78A/22B；23～33min，78A/22B～70A/30B；33～60min，70A/30B～50A/50B；60～65min，50A/50B～ 50A/50B；65～70min，50A/50B～5A/95B。檢測波長為280nm，洗脫劑為甲醇-水（0.05%三氟乙酸），流速為1mL/min，柱溫為30℃。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑種類對總酚、總黃酮和原花青素含量影響

2.1.1 總酚含量分析 通常用于提取的溶劑根據提取目的（制備或分析），提取物質的物理化學性質，試劑及設備的可用性，成本和安全問題進行選擇[18]。根據所提取溶劑的不同，紅皮云杉球果提取物中的總酚含量（TPC）分布在（16.06±1.22）～（88.90±1.37）mg/g，分別為乙酸乙酯和60%的丙酮（圖1），由圖1可知，60%丙酮具有最佳的提取能力。根據TPC提取率（mg/g），在本研究中所用的溶劑提取效果順序為：丙酮（60%），丙酮（40%），乙醇（60%），乙醇（40%），乙醇（80%），丙酮（20%），丙酮（80%），乙醇，乙醇（20%），蒸餾水，丙酮，正丁醇，乙酸乙酯。與以前的研究[19]相一致，我們的研究結果同樣發現TPC提取效果因提取溶劑不同而異。Zielinski&Kozlowska[20]的研究表明，80%的丙酮提取谷類種子中多酚最有效。同樣，Zhou&Yu[21]研究表明，50%丙酮的小麥提取物含有最高的TPC。在另一項研究中發現，從花生殼中提取總酚，80%乙醇和80%的甲醇比水更有效。

2.1.2 總黃酮含量分析 紅皮云杉球果提取物中總黃酮含量從（3.23±0.45）～（47.80±0.86）mg/g變化，分別為乙酸乙酯和60%乙醇。實驗中使用的溶劑對總黃酮的提取效果順序與總多酚含量順序基本相似。Zielinski&Kozlowska[20]研究也表明，從谷物種子中提取黃酮類化合物，80%的丙酮是一種有效的提取溶劑。同樣，有研究證明，有機溶劑（尤其是丙酮或乙醇）加入一定比例水能明顯改進黃酮類化合物的提取產率[22]。

2.1.3 原花青素含量分析 松科植物含有大量原花青素[23]，我們的研究結果證實了這一點。提取物中原花青素的含量（PC）從（3.97±0.56）～（74.26±0.74）mg/g分布，分別是乙酸乙酯和60%的丙酮。從提取效率的角度來看，用60%丙酮提取時原花青素含量最高（平均（75.4±1.42）mg/g，其次是60%乙醇（平均（68.54± 0.95）mg/g）。Chavan等[24]研究表明，從不同的豌豆中提取原花青素，70%的丙酮（加酸或者無酸）的提取效果都要比100%的丙酮溶液提取效果好。選擇含水丙酮做為提取溶劑，是因為它是提取富含原花色素樣品的最有效的媒介[25]。

圖1 紅皮云杉球果不同提取物中酚類物質含量Fig.1 Phenolic contents of different solvent extracts of Picea koraiensis Nakai’s cones

2.2 提取溶劑種類對提取物抗氧化能力的影響

2.2.1 清除DPPH自由基的能力 為了確定最合適的提取溶劑，清除DPPH自由基實驗用于評估提取物的抗氧化能力（如表1所示）。由表1可知，提取溶劑的類型對提取物的總抗氧化能力有顯著的影響。提取物的抗氧化IC50值由（28.272±0.67）μg/mL（60%丙酮提取物），到（103.134±0.77）μg/mL（乙酸乙酯提取物）。60%的丙酮提取物表現出最高的清除能力，其次是Trolox，IC50值分別為（28.272±0.67）μg/mL和（29.103±0.78）μg/mL。60%的乙醇也具有較好的提取效果（IC50值為（34.367±2.01）μg/mL），其次是80%丙酮（IC50值為（36.243±2.03）μg/mL）。用正丁醇，乙酸乙酯，蒸餾水，丙酮，乙醇做為提取劑時，IC50值較高，抗氧化能力較差。其中乙酸乙酯提取物的抗氧化能力最差（IC50值分別為（103.134±0.77）μg/mL）（見表1）。此外，研究發現有機溶劑的水溶液相對于純有機溶劑表現出顯著的抗自由基活性。這些結果表明，有機溶劑的水溶液能更有效的從紅皮云杉球果中提取出有效清除DPPH自由基的化合物。此外，提取物間抗氧化能力的顯著差異，本質上是由于提取溶劑極性的差異，使提取出的抗氧化化合物含量的存在差異[26]。研究表明，溶劑的極性能夠引起植物中的多酚類化合物提取含量的顯著差異[27-28]。

表1 不同溶劑提取物清除DPPH·能力Table 1 DPPH·scavenging activity of different solvent extracts

表2 不同溶劑提取物清除OH·能力Table 2 OH·scavenging activity of different solvent extracts

實驗結果表明，將水添加到有機溶劑（尤其是丙酮和乙醇）中能顯著的改進提取能力和提取物的抗氧化活性[29]。大麥利用丙酮/水（8∶2）的溶劑系統提取后可以獲得具有最高的抗氧化活性。建立相同的溶劑系統，通過比較泰國土著植物中酚類和DPPH自由基清除能力的研究中也得出了這一結論[26]。綜上，有機溶劑的水溶液提取多酚的能力和提取物清除DPPH自由基的能力比其他提取溶劑更強。

2.2.2 清除羥基自由基的能力 在活性氧自由基中，羥基自由基是最活潑的有氧代謝過程中產生的主要的內源性自由基[30]，通常利用2-脫氧-D-核糖方法來評價提取物清除這些自由基的能力。結果表明，所有紅皮云杉球果提取物均具有一定清除活性羥基自由基的能力（如表2所示）。提取物中IC50值最低的是60%丙酮的提取物（50.408±1.38）μg/mL，其次是60%乙醇提取物（56.166±1.67）μg/mL。然而，所有的提取物清除羥基自由基的能力明顯低于抗氧化對照品Trolox（IC50值為（44.085±1.12）μg/mL）。

2.2.3 鐵離子還原能力（FRAP法） 采用了FRAP法來評價提取溶劑對紅皮云杉球果提取物的抗氧化能力的影響（如表3所示）。所有提取物表現出相對較高的抗氧化活性，但60%的丙酮以（5.59±0.38）mmol/L FeSO4當量表現出最高還原能力，其次是40%丙酮和60%乙醇，FeSO4當量分別為（5.30±0.07）mmol/L和（5.02±0.47）mmol/L。所有提取物還原能力的強弱趨勢，類似清除DPPH自由基和羥基自由基能力的趨勢。在三個抗氧化指標中，60%丙酮的提取物的抗氧化活性均為最高的。還原能力可以作為抗氧化能力測定的重要指標[31]。這可能是由于60%丙酮提取物中的總酚含量較高的原因。有研究稱，提取溶劑的極性和提取物中抗氧化物質的不同都會影響提取物的抗氧化能力[25]。還原酮，如抗壞血酸可以通過打破自由基鏈促進還原反應的發生，還可以與過氧化物或者某些過氧化物的前體直接反應，從而防止了過氧化氫的形成[32]。

2.3 相關性分析

利用SPSS13.0軟件分析球果中活性物質的含量與提取物的抗氧化能力的相關性。

SPSS分析結果表明（見表4），總黃酮、原花青素和總酚類物質的含量的相關系數為0.897和0.955，t檢驗的顯著性概率均小于0.01，表明兩種物質和多酚之間顯著相關，且紅皮云杉球果多酚中的原花青素含量較高。三個抗氧化指標的相關性分析，t檢驗的顯著性概率為0.000＜0.01，拒絕零假設，表明三種指標之間相關性分析顯著，且三種活性物質都顯示出較好的抗氧化效果。根據相關系數，在抗氧化指標中原花青素的相關性系數均高于黃酮僅次于多酚，表明原花青素在粗提物總體抗氧化中發揮了主導作用。綜上，由于紅皮云杉球果中原花青素含量較高且抗氧化能力較強，對于紅皮云杉球果中原花青素的進一步研究和分析是必要的。

表3 不同溶劑提取物還原能力（相當于FeSO4的量/mmol/L）Table 3 Reducing powers of different solvent extracts

表4 紅皮云杉球果不同提取物的酚類物質含量和抗氧化能力相關性分析表Table 4 Correlation analysis of the content and antioxidant activities of different solvent extracts of Picea koraiensis Nakai’s cones

2.4 紅皮云杉球果提取物的高效液相色譜初步分析

酚類物質主要以苷元，甙類，酯類的形式存在于植物或細胞壁上。因此，糖苷配基一般用酸性水解來釋放。利用RP-HPLC通過DAD多波長檢測器，根據樣品峰的保留時間和光譜特性，與標準峰比對后，11種酚類化合物被初步鑒定出。紅皮云杉球果提取物的色譜圖確定出9種酚類化合物：沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、香豆酸、白藜蘆醇、蘆丁、肉桂酸、槲皮素（圖2）。此外，由圖2可知，綠原酸、兒茶素是紅皮云杉球果提取物中含量較高的酚類化合物。如表4所示，總酚含量和抗氧化活性之間的相關性較高可能是由于這兩種物質含量較高的原因。已有研究表明抗氧化劑能猝滅自由基、單線態氧和過氧化氫。因此，很多的食品科學家和醫療專業人員都對天然的抗氧化劑感興趣，如多酚類物質[33-34]。

圖2 紅皮云杉球果酚類物質高效液相色譜分析圖。Fig.2 RP-HPLC Chromatographic profiles of phenolic standards，and Picea koraiensis Nakai’s cones extract

雖然抗氧化劑往往被添加到食品中保持食品穩定性，防止出現異味，但其醫療效果已引起了廣泛的興趣。綠原酸和咖啡酸在芳香族殘基上有鄰羥基能清除活性氧（ROS），因此它們具有抗突變，抗癌和體外抗氧化活性[35]。兒茶素是黃酮類化合物，黃酮類化合物因其相對較高的抗氧化能力和在人類飲食的豐富含量而備受關注，潛在抗氧化能力說明在飲食中攝取和治療中使用兒茶素可以顯著的促進健康[36-37]。

如圖2所示，出峰時間在43.768min附近的未知峰的化合物是紅皮云杉球果HPLC圖譜中的主要物質之一，含量很高，并可能具有很強的抗氧化活性。它的結構目前正在調查中。其他含量較小的酚類化合物也不容忽視，因為生物活性是通過不同的化學物質之間的協同工作實現的。

3 結論

綜上，從紅皮云杉球果提取多酚類化合物時，提取溶劑（純有機溶劑或者有機溶劑的水溶液）極性的差異對活性物質含量和提取物的抗氧化活性影響顯著不同。研究后可以得出結論：極性較高的溶劑比低極性的溶劑提取效果更好。一定比例的丙酮和乙醇水溶液可以提高提取能力和抗氧化活性。研究可知：丙酮/水（6∶4）最適合提取紅皮云杉球果的酚類物質（總酚得率為（88.90±1.37）mg/g）且提取物抗氧化能力最強；原花青素含量與總酚類物質的含量相關系數高達0.955，是紅皮云杉球果多酚的主要組成部分；與提取物清除DPPH·、OH·能力和還原力相關系數分別為0.936、0.903、0.940，說明在提取物的整體抗氧化活性起到主導作用。此外，初步鑒定出的綠原酸和兒茶素是紅皮云杉球果提取物中含量較高的酚類化合物，可促進了提取物的抗氧化活性。這些結果表明，從天然來源的生物中選擇性提取高活性物質，適當的選擇提取溶劑很重要。松多酚具有較高的抗氧化活性，并且它可作為一種天然抗氧化劑，廣泛應用于食品、化妝品、功能性食品和醫療領域的。

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Effect of extraction solvents on phenolic contents and antioxidant activities of Picea koraiensis Nakai’s cones

ZHENG Hong-liang1，WANG Ping1，GAO Xin-xin1，WEI Zhen1，WANG Zhen-yu1，2，*
（1.College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.College of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150086，China）

The antioxidant properties and contents of phenolic compounds from Picea koraiensis Nakai’s cones were examined.Three phenolic compounds parameters（total phenols，flavonoids and proanthocyanidins）and three antioxidant properties parameters（scavenging DPPH radicals，scavenging hydroxyl radicals and reducing power）were measured.The results showed that the extracting solvents significantly effected the contents of total polyphenol，flavonoids，proanthocyanidins and antioxidant activities in Picea koraiensis Nakai’s cones. Picea koraiensis Nakai’s cones contained high contents of total phenol（88.90±1.37）mg/g and proanthocyanidins（74.26±0.74mg/g），relatively low flavonoids（47.80±0.86）mg/g.Proanthocyanidins was the major important component of pine polyphenols and played an important role in the antioxidant activities.The chlorogenic acid and catechin identified in Picea koraiensis Nakai’s cones extractation might contribute greatly to the high antioxidant activities of the extracts.

Picea koraiensis Nakai；pine polyphenols；antioxidant；proanthocyanidins

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0127-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.018

2013－09－26 *通訊聯系人

鄭洪亮（1987-），男，碩士研究生，研究方向：功能性植物資源的開發與利用。

國家自然基金資助項目（31170510）。