微生物發酵法預處理植物油脫臭餾出物

胡 弢，杜曉楠，趙國群，2，*（.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊05008；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北石家莊05008）

微生物發酵法預處理植物油脫臭餾出物

胡 弢1，杜曉楠1，趙國群1，2，*
（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018；2.河北省發酵工程技術研究中心，河北石家莊050018）

研究了一種新的植物油脫臭餾出物預處理方法即微生物發酵法。首先篩選出了能代謝利用脂肪酸的熱帶假絲酵母1253，然后使用該酵母發酵大豆油脫臭餾出物。在發酵過程中，隨著菌體的生長，脫臭餾出物中脂肪酸被代謝消耗，提高了其中植物甾醇的含量，成功地實現了脫臭餾出物的濃縮。大豆油脫臭餾出物的適宜發酵培養基為：脫臭餾出物40g/L，尿素1.0g/L，MgSO40.1g/L，K2HPO40.2g/L，KH2PO40.2g/L。將熱帶假絲酵母1253接種到上述培養基中，30℃、200r/min搖床發酵96h，脫臭餾出物中脂肪酸消耗率達到70.21%，其中的植物甾醇含量由起始的15.2%提高到了28.43%。微生物發酵法預處理脫臭餾出物是一種技術上可行的、替代甲酯化預處理的方法。

脫臭餾出物，脂肪酸，植物甾醇，發酵，熱帶假絲酵母

植物油脫臭餾出物是植物油精煉過程中的一個副產品。植物油脫臭餾出物成分非常復雜，主要含有脂肪酸、植物甾醇、維生素E、甘油酯及其他組分，其中脂肪酸含量最高[1-2]。植物油脫臭餾出物是植物甾醇和天然維生素E的主要來源。

由于脂肪酸與植物甾醇、維生素E理化性質比較接近，難于直接進行分離，需采取一定的措施對原料進行適當的預處理，加大脫臭餾出物中脂肪酸與其他成分性質的差異，為后續的分離提取創造良好的條件。因此，采用預處理脫除脂肪酸，通常是從植物油脫臭餾出物中分離提取植物甾醇和天然維生素E的第一步。最常用的預處理方法是將先脂肪酸轉化為沸點較低的脂肪酸甲酯，使其與植物甾醇、維生素E沸點差達60℃以上，再采用真空蒸餾等手段將脂肪酸甲酯脫除，獲得濃縮的脫臭餾出物，從而簡化后續的植物甾醇與維生素E的分離工藝[3]。目前脂肪酸的甲酯化主要有化學法和酶法?；瘜W酯化法的缺點是使用大量濃硫酸、甲醇，腐蝕設備，污染環境[4]。酶酯化法的優點是反應條件溫和，催化效率高，無三廢排放，但脂肪酶價格高，操作壽命短[5-7]。

針對植物油脫臭餾出物預處理工藝存在的問題，本文嘗試了一種新的預處理方法即微生物發酵法，通過發酵過程中微生物生長所造成的脫臭餾出物中脂肪酸的消耗，實現了脫臭餾出物的濃縮；同時所收獲的微生物細胞，干燥后還可作為動物飼料。作為甲酯化的替代工藝，這種微生物發酵預處理方法成本低、能耗小、無環境污染，對于植物甾醇和天然維生素E生產過程的節能減排具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆油脫臭餾出物（Soybean oil deodorizer distillate，SODD） 石家莊益海糧油有限公司提供，經測定，其中含66.13%游離脂肪酸、15.2%植物甾醇；熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）1253、產朊假絲酵母（Candida utilis）1769、扣囊復膜孢酵母（Fibuligera）1717、白地霉（Geotrichum candidum）1745 中國工業微生物菌種保藏中心。

LG16-B型高速離心機 北京雷勃爾設備有限公司；752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；ZHWY-2102C型恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養基 葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，K2HPO42.0g/L，pH7.2。

1.2.2 平板篩選培養基 大豆油脫臭餾出物60g/L，酵母粉0.5g/L，瓊脂18g/L，pH7.0。

1.2.3 發酵基本培養基 大豆油脫臭餾出物50g/L，酵母粉1.0g/L，MgSO40.1g/L，K2HPO40.2g/L，KH2PO40.2g/L，pH7.0。

1.2.4 種子液的制備 將2～3環斜面培養物接種至裝有100mL種子培養基的250mL三角瓶中，30℃、200r/min搖床振蕩培養24h。

1.2.5 微生物菌種的篩選 分別將制備好的熱帶假絲酵母1253、產朊假絲酵母1769、扣囊復膜孢酵母1717、白地霉1745種子液涂布到平板篩選培養基上，30℃恒溫培養，定期觀察菌落生長情況。

1.2.6 脫臭餾出物的發酵 將熱帶假絲酵母1253種子液以5%（v/v）的接種量，接種到裝有100mL發酵基本培養基的250mL三角瓶中，于30℃、200r/min的搖床中發酵108h。

1.2.7 脫臭餾出物起始濃度對脂肪酸消耗的影響 將發酵基本培養基中脫臭餾出物含量分別調整為40、50、60、80、100g/L，其他組分保持不變。按5%接種量接入熱帶假絲酵母1253種子液，30℃、200r/min，搖床發酵96h。

1.2.8 氮源對脂肪酸消耗的影響 將發酵基本培養基中脫臭餾出物含量調整為40g/L，其中的氮源分別調整為（1.0g/L）：酵母粉、蛋白胨、尿素、（NH4）2SO4，NH4Cl和NH4H2PO4。接入熱帶假絲酵母1253種子液后，30℃、200r/min搖床發酵96h。

1.2.9 無機鹽的影響 將發酵基本培養基調整為脫臭餾出物含量40g/L、尿素1.0g/L、K2HPO40.2g/L、KH2PO40.2g/L，并其分別添加0.1g/L MgSO4·7H2O、0.01g/L FeSO4·7H2O、0.05g/L ZnSO4·7H2O、0.02g/L MnCl2·4H2O、0.1g/L CaCl2·2H2O和0.02g/L CoCl2·6H2O；沒有添加無機鹽的發酵基本培養基設為對照。上述培養基接種熱帶假絲酵母1253后，30℃、200r/min搖床發酵96h。

1.2.10 植物甾醇釋放的監測 將發酵培養基調整為：脫臭餾出物含量40g/L、尿素1.0g/L、MgSO40.1g/L，K2HPO40.2g/L，KH2PO40.2g/L。接種熱帶假絲酵母1253后，30℃、200r/min搖床發酵96h，定期取樣，監測發酵液中植物甾醇的含量。

1.3 測定方法

1.3.1 熱帶假絲酵母菌體生長的測定 取1.0mL發酵液，8000r/min離心10min，所獲得的沉淀在80℃烘箱中烘干至恒重，稱量得菌體干重（g/L）。

1.3.2 脫臭餾出物中脂肪酸的測定 發酵結束后，發酵液降溫至4℃，靜止放置2h，將凝固的殘存脫臭餾出物分離出來，在80℃烘箱中烘干至無游離水，然后參照國家標準GB/T 5530-2005《動植物油脂酸值和酸度測定》（以油酸計）進行脂肪酸的測定。

1.3.3 脫臭餾出物及發酵液中植物甾醇的檢測 采用磷硫鐵色法測定[8]。

2 結果與分析

2.1 微生物菌種的篩選

用于脫臭餾出物發酵的理想微生物菌種應為：a.能高效代謝利用脫臭餾出物中的游離脂肪酸及甘油酯；b.菌體有其他工業價值，如可用作單細胞蛋白。產朊假絲酵母、熱帶假絲酵母、扣囊復膜孢酵母、白地霉菌均可作為單細胞蛋白發酵生產菌，因此，選擇這4種酵母菌作為研究對象。

圖1 熱帶假絲酵母1253在平板篩選培養基上生長的菌落Fig.2 The colonies of C.tropicalis 1253 grown the screening agar medium

將上述4種酵母菌的種子液，適當稀釋后涂布于以脫臭餾出物為唯一底物的平板篩選培養基上，然后30℃下恒溫培養。經過約4d的培養之后，發現只有熱帶假絲酵母1253生長出許多菌落（圖1），而其他三個實驗菌株均未發現有菌落出現。這種結果說明，只有熱帶假絲酵母能以脫臭餾出物中脂肪酸及甘油酯為碳源進行生長。韓云等也發現熱帶假絲酵母可以高效降解色拉油加工廢水中的脂肪酸和油脂[9]。在有氧情況下，脂肪酸在熱帶假絲酵母體內經過β-氧化和三羧酸循環途徑最終降解為二氧化碳和水，從而為菌體生長提供了必要的碳源和能源物質[10]。因此，選擇熱帶假絲酵母1253為脫臭餾出物發酵的適宜菌株。

2.2 脫臭餾出物發酵

熱帶假絲酵母1253發酵大豆油脫臭餾出物的實驗結果見圖2。如圖2所示，在第一發酵階段（0～12h），酵母細胞呈現快速生長，細胞干重從1.47g/L快速增加至5.67g/L，但脫臭餾出物中脂肪酸的濃度幾乎不降低，脂肪酸沒有被消耗，這意味著這一階段菌體生長所消耗的碳源不是脂肪酸，其可能的原因是：脂肪酸及甘油酯是一個相對不易利用的碳源，而酵母粉既是良好的氮源，也是良好的碳源，從而被優先利用。在這一發酵階段，脫臭餾出物中甾醇的濃度也幾乎沒有增加。在第二發酵階段（12～36h），細胞生長緩慢，然而脫臭餾出物中脂肪酸濃度卻明顯下降。這可能表明發酵培養基中的酵母粉已被消耗殆盡，而脂肪酸開始作為碳源而被代謝利用，因而細胞對碳源轉化有一個適應期，表現為生長緩慢。由于脂肪酸的消耗，因而觀測到脫臭餾出物中植物甾醇濃度增加。在第三發酵階段（36～96h），細胞再次快速生長，出現二次生長現象。與此同時，脂肪酸的消耗和脫臭餾出物中植物甾醇濃度也快速增加，但細胞的生長速率要大于脂肪酸的消耗速率，這表明脫臭餾出物的其他成分如甘油酯在細胞生長時也被代謝利用。在發酵的最后階段（96～108h），細胞生長幾乎停止，脫臭餾出物中脂肪酸濃度略有下降。經過發酵，脫臭餾出物中脂肪酸濃度由開始的66.13%降低為38.46%，而植物甾醇濃度從15.2%增加為23.91%，實現了脫臭餾出物的濃縮。

圖2 熱帶假絲酵母1253發酵大豆油脫臭餾出物Fig.2 Fermentation of SODD with C.tropicalis 1253

2.3 發酵培養基對脂肪酸消耗的影響

2.3.1 脫臭餾出物起始濃度的影響 植物油脫臭餾出物不溶于水，因而漂浮在培養基的表面，形成一個油層；而熱帶假絲酵母發酵脫臭餾出物是一個好氧過程，漂浮的脫臭餾出物對發酵體系的傳質和傳氧均有影響，因此，培養基中脫臭餾出物的起始濃度是一個很重要參數。如表1所示，隨著培養基中脫臭餾出物起始濃度的增加，酵母細胞的生長而逐漸降低。脫臭餾出物起始濃度越高，菌體生長越差，在脫臭餾出物中殘存的脂肪酸越多，這與高起始濃度所造成的氧氣供給不足有關；與之相對應，脂肪酸消耗率和植物甾醇含量也越低。如果降低脫臭餾出物起始濃度，可改善菌體生長，提高脂肪酸消耗率，但發酵罐的發酵能力會降低。通過加強通氣和攪拌應會在較大程度上克服這個問題。

2.3.2 氮源的影響 氮源是微生物生長最重要的營養成分之一。為了確定熱帶假絲酵母1253發酵脫臭餾出物的適宜氮源，在發酵培養基中分別使用了幾種有機與無機氮源，實驗結果見表2。從表2中可以看出，無機氮源使得酵母細胞生長好于有機氮源。尤其是，當尿素為氮源時，菌體生長得最好，發酵后脫臭餾出物中脂肪酸含量最低（37.36%），脂肪酸消耗率高達69.45%。有機氮源如酵母粉富含蛋白質、氨基酸、維生素、微量元素等營養成分。當碳源為葡萄糖時，就微生物的生長而言，通常有機氮源要好于無機氮源。之所以出現上述實驗結果，很可能與碳源由葡萄糖轉化為脂肪酸有關。

表1 脫臭餾出物起始濃度對其發酵的影響Table 1 Effect of initial SODD concentration on fermentation of SODD

表2 氮源對脫臭餾出物發酵的影響Table 2 Effect of nitrogen source on fermentation of SODD

2.3.3 無機鹽的影響 無機鹽也是微生物生長的重要營養成分。表3是6種無機鹽對熱帶假絲酵母1253發酵脫臭餾出物影響的實驗結果。從表3中可以發現，無機鹽對菌體生長及脂肪酸代謝有很大影響。同沒有添加無機鹽的對照相比，FeSO4、CoCl2、ZnSO4、MnCl2均顯著抑制細胞生長，降低脂肪酸消耗率。特別是，MnCl2在實驗濃度下顯示出了強烈的抑制生長作用，而CaCl2則對熱帶假絲酵母1253生長幾乎沒有影響。在所實驗的6種無機鹽中，只有MgSO4表現出了非常顯著的刺激細胞生長的作用。當發酵培養基中添加0.1g/L MgSO4·7H2O時，脂肪酸消耗率達到70.21%，發酵后的脫臭餾出物植物甾醇含量達到28.43%。微生物細胞生長對Mg2+有較高的需求，而且這種需求是不能被其他金屬離子代替的。Mg2+參與酵母細胞生長及代謝的調節，Mg2+的缺乏影響酵母細胞的生長[11]。

表3 無機鹽對脫臭餾出物發酵的影響Table 3 Effect of mineral salts on fermentation of SODD

2.4 植物甾醇的釋放

在植物油脫臭餾出物中，植物甾醇是與脂肪酸、維生素E、甾醇酯、甘油酯等成分是混合在一起的。為確定在脫臭餾出物的發酵過程中，隨著脂肪酸的代謝消耗，植物甾醇是否會釋放進入發酵液，監測了脫臭餾出物發酵過程中發酵液中的植物甾醇含量，實驗結果見圖3。如圖3所示，發酵液中植物甾醇的濃度隨著發酵時間的延長而增加，這表明脫臭餾出物中一部分植物甾醇已經被釋放到了發酵液中。然而，所釋放的植物甾醇總量很低，植物甾醇的損失量僅為0.036%，因此，其損失可以忽略不計。發酵過程中植物甾醇損失量微小與植物甾醇不溶于水的特性有很大關系。

圖3 大豆油脫臭餾出物發酵期間植物甾醇的釋放Fig.3 Release of phytosterols form SODD during fermentation

3 結論

本研究采用以大豆油脫臭餾出物為唯一碳源的培養基，篩選出了能代謝利用脂肪酸的熱帶假絲酵母1253，并使用該酵母液態深層發酵大豆油脫臭餾出物。實驗結果表明，在發酵過程中，隨著菌體的生長，脫臭餾出物中的脂肪酸作為碳源被代謝消耗，從而提高了其中的植物甾醇含量，成功地實現了脫臭餾出物的濃縮。在發酵過程中，植物甾醇的損失微小，可以忽略不計。這種預處理方法在常溫常壓下進行，發酵后濃縮的脫臭餾出物易于與微生物菌體分離，不需價格高昂脂肪酶，不使用有毒有害的物質，沒有環境污染。發酵所產生的菌體，干燥后還可作為單細胞蛋白用于動物飼料。因此，微生物發酵法是一種技術上可行的替代化學法和酶法預處理的方法。實驗結果還表明，大豆油脫臭餾出物的適宜發酵培養基為：脫臭餾出物40g/L，尿素1.0g/L，MgSO40.1g/L，K2HPO40.2g/L，KH2PO40.2g/L。將熱帶假絲酵母1253種子液接種到上述培養基中，于30℃、200r/min的搖床進行發酵。經過96h發酵，脫臭餾出物中脂肪酸消耗率達到70.21%，其中的植物甾醇含量由起始的15.2%提高到了28.43%。大豆油脫臭餾出物也含有維生素E。在本研究中，沒有監測發酵過程中維生素E的變化，但發酵后維生素E含量也應會相應增加。然而，在本實驗條件下，微生物發酵法預處理后大豆油脫臭餾出物中植物甾醇含量達到了28.43%，而其植物甾醇含量的理論最大值為44.87%；植物油脂脫臭餾出物成分復雜，可能影響熱帶假絲酵母生長的因素較多，熱帶假絲酵母在以脫臭餾出物為底物時的生長速度遠低于葡萄糖，因此，脫臭餾出物的微生物發酵工藝還有待于進一步優化和改善。

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圖7 經凍融和高溫滅菌處理后塔拉膠溶液（0.5%，w/v）的黏度Fig7 The apparent viscosity of tara gum solution（0.5%，w/v）with freezing-thawing and heat-pressure treatments

2.8 塔拉膠的動態流變特性

預實驗表明，在振蕩應力0.7～1.9Pa內，塔拉膠溶液處于線性粘彈區，其復合模量G*呈線性變化。因此，實驗中固定振蕩應力為1.1Pa，探討了濃度為1%（w/v）的塔拉膠溶液的動態流變性質[15]。在動態流變學研究中，儲能模量G′表示應力能量暫時儲存，之后可以恢復，反映物質的類固體性質即彈性；損耗模量G″表示流動所耗能量，是不可逆的，轉變為剪切熱，反映物質的類液體性質即粘性[8，16]。由圖8可知，塔拉膠溶液（1%，w/v）的動態黏度η′隨振蕩頻率增加而降低，表現為剪切稀化，這與靜態流變研究結果相符。另外，塔拉膠溶液具有一定的粘彈性，其在低頻區域，G″＞G′，表現為似液體的粘性流動行為；然而在高頻區，G′＞G″，表現為似固體的彈性行為，其動態模量交點為2.8Hz。

圖8 塔拉膠溶液（1.0%，w/v）的動態流變特性Fig.8 Mechanical spectra of tara gum solution（1.0%，w/v）注：剪切應力：1.1Pa。

3 結論

靜態流變研究表明，塔拉膠溶液為假塑性流體，不具有觸變性，其表觀黏度隨剪切速率增加而降低，并隨濃度升高而增大，其流動模型符合冪律模型。鹽（NaCl、CaCl2）、蔗糖和溫度對塔拉膠溶液的黏度均有一定的影響，但酸堿環境對其黏度影響不大。經凍融處理后，塔拉膠溶液黏度仍可保持相對穩定，但經高溫滅菌鍋處理后其黏度有所降低。動態流變研究表明，塔拉膠溶液具有一定的粘彈性。上述研究結果為塔拉資源開發以及塔拉多糖在食品和日用化工的高值利用提供了參考。

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Pretreatment of vegetable oil deodorizer distillate by microbial fermentation

HU Tao1，DU Xiao-nan1，ZHAO Guo-qun1，2，*
（1.College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China；2.Fermentation Engineering Center of Hebei Province，Shijiazhuang 050018，China）

A new pretreatment method，microbial fermentation of vegetable oil deodorizer distillate（VODD），was tried in this work.A yeast strain Candida tropicalis1253 was screened，which could utilize fatty acids as carbon source for cell growth，and was fermented soybean oil deodorizer distillate（SODD）.During the fermentation，fatty acids in SODD were utilized and converted into cellular components as the yeast cells grew，phytosterols concentration in SODD increased，and SODD was successfully concentrated.The optimal cultural medium of SODD was：SODD 40g/L，urea 1.0g/L，MgSO40.1g/L，K2HPO40.2g/L，KH2PO40.2g/L.The medium above was inoculated with Candida tropicalis1253，and the cultures were fermented at 30℃ in a shaker at 200r/min for 96h.When the fermentation was finished，consumption of fatty acids in SODD was 70.21%，and phytosterols concentration in SODD increased from 15.2%to 28.43%.Pretreatment of VODD by microbial fermentation was a technically feasible process and can replace pretreatment of methyl esterification of fatty acids in VODD.

deodorizer distillate；fatty acids；phytosterols；fermentation；Candida tropicalis

TS229

A

1002-0306（2014）12-0147-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.023

2013－09－02 *通訊聯系人

胡弢（1977-），男，博士，講師，研究方向：生物催化技術。

河北省高?？茖W研究優秀青年基金項目（Y2011106）。