牧區(qū)牦牛“曲拉”優(yōu)質(zhì)發(fā)酵劑的研究

王琳琳，王 軍，韓 玲，*，文鵬程，丁考仁青（.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；.甘南州畜牧科學(xué)研究所，甘肅合作747000）

牧區(qū)牦牛“曲拉”優(yōu)質(zhì)發(fā)酵劑的研究

王琳琳1，王 軍1，韓 玲1，*，文鵬程1，丁考仁青2
（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘南州畜牧科學(xué)研究所，甘肅合作747000）

以脫脂牦牛乳為研究對象，滴定酸度為考察指標(biāo)，利用3株具有較強發(fā)酵能力的乳酸菌：保加利亞乳桿菌（MGD1-3）、嗜熱鏈球菌（MGB39-5）和植物乳桿菌（BM5152）為因子，研究并篩選3株菌在脫脂牦牛乳中的最佳接種量。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面中心旋轉(zhuǎn)組合實驗對影響牦牛“曲拉”發(fā)酵效果的3個因子進行了優(yōu)化，建立并分析了各因子與響應(yīng)值的數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明：在42℃條件下發(fā)酵3.5h，3個因素對發(fā)酵牦牛乳滴定酸度的影響大小依次為：MGD1-3＞MGB39-5＞BM5152；3株菌MGD1-3、MGB39-5、BM5152最佳組合的接種量為：5.29、7.18、6.30lgcfu/mL，在此條件下制作牦牛“曲拉”，其發(fā)酵滴定酸度為71.90°T。接種等量優(yōu)化組合發(fā)酵劑與牧區(qū)含菌乳清液于脫脂牦牛乳中進行驗證實驗，其發(fā)酵時間極顯著的縮短了8.7h（p＜0.01）、滴定酸度顯著的提高了3.97°T（p＜0.05）、活菌數(shù)極顯著的增加了7.9×107cfu/mL（p＜0.01）。

曲拉，乳酸菌，優(yōu)質(zhì)發(fā)酵劑，響應(yīng)面設(shè)計

牦牛“曲拉”是牧民將牦牛乳脫脂后，在自然條件下發(fā)酵使酪蛋白凝固，風(fēng)干而制成的粗奶酪，是干酪素生產(chǎn)的主要原料之一[1]。在中國乃至世界上只有甘青川三省交界的青藏高原牧民有將牦牛乳制成“曲拉”的生活習(xí)慣，是中國獨有的資源[2-3]。到目前為止，牧區(qū)主要還是沿用傳統(tǒng)粗放式發(fā)酵工藝制作“曲拉”，其發(fā)酵菌種雜、溫度低、無統(tǒng)一接種量以及干燥方式開放等缺點，導(dǎo)致制作“曲拉”存在氧化酸敗嚴重、褐變發(fā)暗、雜質(zhì)含量高等影響品質(zhì)的問題。“曲拉”品質(zhì)的優(yōu)劣與制作工藝各個環(huán)節(jié)密切相關(guān)，尤其在發(fā)酵階段，菌種純度、發(fā)酵性能以及接種量決定其發(fā)酵酸度、發(fā)酵快慢以及酪蛋白是否沉淀完全[4-6]。因此，優(yōu)質(zhì)“曲拉”發(fā)酵劑的研究，對品質(zhì)良好“曲拉”的生產(chǎn)制作有重要意義。而在近年來的相關(guān)研究中，秦虹等[7]研究了牧區(qū)酸奶優(yōu)質(zhì)發(fā)酵劑對酸奶品質(zhì)的影響，Lin等[8]也研究了發(fā)酵劑菌種不同配比與純度對酸奶品質(zhì)的影響，共同指出菌種純度越高，酸奶發(fā)酵效果越好。Larsson等[9]和Oliveiraa等[10]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵劑產(chǎn)酸過快，會使發(fā)酵乳質(zhì)地粗糙、黏度降低并析出大量的乳清，且在貯藏過程中活菌數(shù)下降、后酸化增強，從而影響發(fā)酵乳的貨架期。若發(fā)酵劑產(chǎn)酸過慢，會使發(fā)酵乳的發(fā)酵時間延長，產(chǎn)酸不足，導(dǎo)致發(fā)酵乳的品質(zhì)變差。Cakmakci等[11]研究了發(fā)酵效果對貯藏期影響，并指出發(fā)酵速度越慢導(dǎo)致乳脂肪氧化越嚴重，進而明顯縮短產(chǎn)品貨架期。雖然，國內(nèi)外關(guān)于牧區(qū)酸奶發(fā)酵劑的研究很多，然而，關(guān)于牦牛“曲拉”發(fā)酵劑菌種種類、純度以及發(fā)酵效果的研究與報道相對不足。

因此，本研究以脫脂牦牛乳為研究對象，滴定酸度為考察指標(biāo)，利用3株篩自牧區(qū)的乳酸菌：保加利亞乳桿菌（MGD1-3）、嗜熱鏈球菌（MGB39-5）和植物乳桿菌（BM5152）為因子，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面中心旋轉(zhuǎn)組合實驗對影響牦牛“曲拉”發(fā)酵效果的3個因子進行了優(yōu)化，建立并分析了各因子與響應(yīng)值的數(shù)學(xué)模型。從而得出3株菌最佳接種量參數(shù)，為牧區(qū)優(yōu)質(zhì)“曲拉”生產(chǎn)提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MGD1-3（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）、MGB39-5（Streptococcus thermophilus）、BM5152（Lactobacillus plantarum） 均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室篩選；脫脂牦牛乳（脂肪1.03%、蛋白質(zhì)5.22%、干物質(zhì)17.28%、乳糖3.2%） 采自甘南牧區(qū)，現(xiàn)場采用電動式奶油分離機進行脫脂并進行巴氏殺菌，裝罐后置于含冰低溫采樣箱帶回實驗室，-4℃冷藏備用；發(fā)酵乳清液 采自甘南牧區(qū)，經(jīng)自然發(fā)酵所得，裝罐后置于含冰低溫采樣箱帶回實驗室，-4℃冷藏備用；MRS培養(yǎng)基（用于桿菌） 細菌蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏粉5.0g、D-葡萄糖20.0g、Tween-80 1.0g、K2HPO42.0g、醋酸鈉5.0g、檸檬酸三鈉水合物2.0g、MgSO4·7H2O 200mg、MnSO4·5H2O 54.0mg、蒸餾水1000mL（pH6.5）；M17培養(yǎng)基（用于球菌） 胰蛋白胨5.0g、大豆蛋白凍5.0g、牛肉膏5.0g、酵母膏2.5g、VC0.5g、硫酸鎂0.25g、β-甘油磷酸鈉5.0g，配成478mL（pH6.7～7.1）。

SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；YX280A型手提式壓力蒸汽滅菌器 上海醫(yī)用核子儀器廠；HG3034A型電熱培養(yǎng)箱 南京飛騰實驗儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海虹益儀器儀表有限公司；BSA224S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；L500型臺式低速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化與傳代 開啟乳酸菌干粉安瓿管，加入適量生理鹽水，溶解混勻，吸取500μL菌液，分別接種于5mL MRS和M17的液體培養(yǎng)基試管中，在37℃條件下恒溫培養(yǎng)24h。在相同培養(yǎng)條件下傳代2～3次，直至菌體達到對數(shù)生長期，然后進行革蘭氏染色與活菌數(shù)測定。

1.2.2 滴定酸度測定 根據(jù)GB/T 5413.34-2010方法進行測定。

1.2.3 活菌數(shù)測定 根據(jù)GB 4789.2-2010方法進行測定。

1.3 單因素實驗

乳酸菌MGD1-3、MGB39-5、BM5152均以3、4、5、6、7、8lgcfu/mL濃度接種于滅菌脫脂牦牛乳中，42℃條件下發(fā)酵3.5h，測定其滴定酸度與活菌數(shù)[12]。

1.4 乳酸菌不同接種量對滴定酸度參數(shù)的優(yōu)化

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取MGD1-3、MGB39-5和BM5152作為多因素交叉組合實驗的考察因素，以42℃條件下發(fā)酵3.5h的滴定酸度為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面中心旋轉(zhuǎn)組合方式對乳酸菌不同接種量影響牦牛乳滴定酸度參數(shù)進行優(yōu)化，共設(shè)計實驗20組，每組做3個平行，利用Design-Expert 8.05b軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理，以獲得最佳參數(shù)。每一個自變量的低、中、高實驗水平分別以-1、0、+1進行編碼。實驗因素水平編碼表見表1。

表1 實驗因素水平編碼表Table 1 Test factor levels and coding

1.5 驗證實驗

將最優(yōu)復(fù)配組合（實驗組）與采自牧區(qū)含菌乳清液（作對照）以同樣的接種量分別接種于滅菌脫脂牦牛乳中，42℃培養(yǎng)，觀察直至酪蛋白完全沉淀，分別記錄發(fā)酵完全所需時間并測定發(fā)酵乳清液的滴定酸度及乳酸菌活菌數(shù)[12]，每組實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有測定數(shù)據(jù)，采用Microsoft 2007 Excel整理數(shù)據(jù)，SPSS 19.0和Design Expert 8.05b進行數(shù)據(jù)處理及分析。

圖1 MGD1-3不同接種量對滴定酸度的影響Fig.1 The effect of different MGD1-3 inoculation quantity on titratable acidity

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 MGD1-3不同接種量對滴定酸度的影響 由圖1可知，隨著MGD1-3接種量的增加，牦牛乳滴定酸度呈上升趨勢，接種量達到5lgcfu/mL時接種量的增加對滴定酸度的影響顯著減小（p＜0.05），滴定酸度接近最大值，繼續(xù)增大接種量會造成菌種浪費，但對發(fā)酵酸度的貢獻不大，因此，選擇較合理MGD1-3的接種量為5lgcfu/mL附近。

2.1.2 MGB39-5不同接種量對滴定酸度的影響 如圖2所示，隨著MGB39-5接種量的增加，牦牛乳滴定酸度總體呈上升趨勢，但當(dāng)接種量在4～6lgcfu/mL范圍時，滴定酸度基本呈直線上升，當(dāng)接種量達到7lgcfu/mL后滴定酸度增加不再顯著（p＞0.05），因此，選擇較合理MGB39-5的接種量為7lgcfu/mL附近。

圖2 MGB39-5不同接種量對滴定酸度的影響Fig.2 The effect of different MGB39-5 inoculation quantity on titratable acidity

2.1.3 BM5152不同接種量對滴定酸度的影響 如圖3可知，隨著BM5152接種量的增加，牦牛乳滴定酸度呈升高趨勢，當(dāng)接種量達到6lgcfu/mL后其滴定酸度增加趨于緩和，且不具有顯著性（p＞0.05），繼續(xù)增加接種量，對發(fā)酵效果影響較小，并且會造成菌種浪費和成本的增加，因此，較佳BM5152的接種量為6lgcfu/mL附近。

圖3 BM5152不同接種量對滴定酸度的影響Fig.3 The effect of different BM5152 inoculation quantity on titratable acidity

2.2 響應(yīng)面分析法對滴定酸度參數(shù)的優(yōu)化

對MGD1-3（X1）、MGB39-5（X2）、BM5152（X3）進行了3因素3水平響應(yīng)面分析，3株菌對脫脂牦牛乳發(fā)酵滴定酸度的影響三因素二次回歸旋轉(zhuǎn)組合實驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2和表3。

表2 響應(yīng)面分析實驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Arrangement of central composite design and corresponding test values of yak meat-tenderization by the papain

表3 回歸模型方差分析及其系數(shù)的顯著性檢驗Table 3 Regression model analysis of variance and coefficient of significance test

利用Design-Expert 8.05b對表2的實驗數(shù)據(jù)進行方差分析、參數(shù)估計及顯著性檢驗，具體結(jié)果分析見表3，得到滴定酸度與3株菌MGD1-3、MGB39-5、 BM5152接種量的標(biāo)準三元二次回歸方程為：

Y=71.41495+1.71774X1+1.06639X2+0.90031X3-0.31250X1X2+0.58750X1X3+0.16250X2X3-3.12056X12-2.78468X22-1.81214X32。

由方差分析可以看出，回歸模型F＝43.33，p＜0.01，說明響應(yīng)面回歸達到極顯著；失擬項p＝0.2729＞0.05，因此，失擬檢驗不顯著，說明模型所擬合的二次回歸方程與實際相符合，能正確反映滴定酸度Y與X1、X2和X3之間的關(guān)系，回歸模型可以較好地對優(yōu)化實驗中的各種實驗結(jié)果進行預(yù)測[13-14]。顯著性檢驗結(jié)果表明，3株菌MGD1-3、MGB39-5、BM5152的接種量對滴定酸度均有極顯著影響（p＜0.01），決定系數(shù)R2為0.9750，說明模型的擬合度較好，滴定酸度的實際值與預(yù)測值之間具有較好的擬合相關(guān)性。方差分析結(jié)果表明，各因素對發(fā)酵牦牛乳滴定酸度的影響大小順序依次為：MGD1-3＞MGB39-5＞BM5152。

對3株菌MGD1-3、MGB39-5、BM5152的接種量3個因素，兩兩交互作用分析，得到交互因子的響應(yīng)曲面圖，見圖4。在等高線區(qū)域中心，滴定酸度最高，由中心向邊緣逐漸減小。若底部投影為橢圓形，則兩因素交互作用顯著，由此可知MGD1-3與MGB39-5、MGD1-3與BM5152、MGB39-5與BM5152之間的交互作用均不具有顯著性（p＞0.05）。

圖4 交互因子的響應(yīng)曲面和等高線Fig.4 Interaction factor of response surface and contour

通過回歸方程對各因素求導(dǎo)，得出3株菌MGD1-3、MGB39-5、BM5152對脫脂牦牛乳發(fā)酵滴定酸度的最佳接種量參數(shù)為：5.29、7.18、6.30lgcfu/mL，在該組合條件下，得滴定酸度的理論值為71.90°T。

2.3 驗證實驗

接種等量最優(yōu)組合發(fā)酵劑（實驗組）與牧區(qū)傳統(tǒng)含菌乳清液（對照組）驗證實驗結(jié)果如表4所示。表明該優(yōu)化組合發(fā)酵劑發(fā)酵性能良好，其發(fā)酵時間極顯著的縮短了8.7h（p＜0.01）、滴定酸度顯著的提高了3.97°T（p＜0.05）、活菌數(shù)極顯著的增加了7.9×107cfu/mL（p＜0.01）。

表4 驗證實驗結(jié)果Fig.4 The result of verification test

3 結(jié)論

3.1 通過3株菌不同接種量進行單因素實驗，并進行接種量與滴定酸度之間的顯著性分析，以及從經(jīng)濟成本等方面綜合考慮，最終選出3株菌MGD1-3、MGB39-5、BM5152的最佳接種量分別在5、7、6lgcfu/mL附近。

3.2 通過響應(yīng)面設(shè)計與分析，得出3株菌對滴定酸度的影響大小依次為：MGD1-3＞MGB39-5＞BM5152。最佳接種量為：5.29、7.18、6.30lgcfu/mL，在該組合條件下，得滴定酸度的理論值為71.90°T。

3.3 由驗證實驗得到優(yōu)化組合的發(fā)酵劑比牧區(qū)含菌乳清發(fā)酵時間極顯著的縮短了8.7h（p＜0.01）、滴定酸度顯著的提高了3.97°T（p＜0.05）、活菌數(shù)極顯著的增加了7.9×107cfu/mL（p＜0.01）。

[1]韓玲，許敬東，張福娟，等.牦牛“曲拉”乳酸干酪素生產(chǎn)工藝研究[J].中國乳品工業(yè)，2006，34（2）：36-39.

[2]甘伯中，常海軍，余群力，等.牦牛曲拉干酪素脫色工藝優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2006，22（10）：203-207.

[3]Mao X Y，Ni J R，Sun W L，et al.Value-added utilization of yak milk casein for the production of angiotensin-I-converting enzyme inhibitory peptides[J].Food Chemistry，2007，103（4）：1282-1287.

[4]王貴芳.農(nóng)家干酪的制作工藝[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2009，27（9）：72-73.

[5]Wang P J，Liu H N，Wen P C，et al.The composition，size and hydration of yak casein micelles[J].International Dairy Journal，2013，31（2）：107-110.

[6]司克輝，張麗，張敏.甘肅省肅南牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛乳優(yōu)良乳酸菌株的篩選[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，46（3）：112-116.

[7]秦虹，梁琪，張衛(wèi)兵，等.源自合作藏區(qū)優(yōu)良乳酸菌的酸奶發(fā)酵劑發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2013，34（6）：231-236.

[8]Lin W H，Hwang C F，Chen L W，et al.Viable counts，characteristic evaluation forcommerciallactic acidbacteria products[J].Food Microbiology，2006，23（1）：74-81.

[9]Larsson C.Effects on product quality for probiotic yoghurts caused by long storage times during production[D].Sweden：Linkoping University，2009.

[10]Oliveiraa M N，Sodini I，Remeuf F，et al.Effect of milk supplementation and culture composition on acidification，textural properties and microbiological stability of fermented milks containing probiotic bacteria[J].International Dairy Journal，2001，11（11-12）：935-942.

[11]Cakmakci S，Cetin B，Turgut T，et al.Probiotic properties，sensory qualities，and storage stability of probiotic banana yogurts [J].Turk J Vet AnimSci，2012，36（3）：231-237.

[12]Azzolini M，Tosi E，Veneri G，et al.Evaluating the efficacy of lysozyme against lactic acid bacteria under different winemaking scenarios[J].Efficacy of Lysosyme in Winemaking，2010，31（2）：99-105.

[13]Forde A，F(xiàn)itzgerald G F.Biotechnological approaches to the understanding and improvement of mature cheese flavour[J]. Current Opinion in Biotechnology，2000，11（5）：484-489.

[14]Adhikari K，Heymann H，Huff H.Textural characteristics of low fat，full fat and smoked cheeses：sensory and instrumental approaches[J].Food Quality and Preference，2003，14（3）：211-218.

表5 鈉替代及預(yù)乳化豆油對乳化腸感官評定的影響Table 5 Effect of sodium substituting and pre-emulsifying oil on sensory evaluation of emulsion-type sausages

參考文獻

[1]Ruusunen M，Puolanne E.Reducing sodium intake from meat products[J].Meat Science，2005，70（3）：531-541.

[2]Sofos J N.Antimicrobial effects of sodium and others ions in foods：a review[J].Journal of Food Safety，1984，6（1）：45-78.

[3]郝紅濤，趙改名，李苗云，等.低脂低鈉肉類制品的研究進展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（2）：163-167.

[4]魏朝貴，吳菊清，邵俊花，等.降低乳化型肉制品中食鹽含量研究進展[J].肉類研究，2012，26（4）：28-31.

[5]王健.低脂肉制品技術(shù)研究[D].天津：天津商業(yè)大學(xué)，2011：5-8.

[6]Z.Pietrasik.Binding and textural properties of beef gels processed with k-carrageenan，egg albumin and microbial transglutaminase[J].Meat Science，2003，63：317-324.

[7]Farouk M，Wieliczko K J，Merts I.Ultra-fast freezing and low storage temperatures are not necessary to maintain the functional properties of manufacturing beef[J].Meat Science，2006（1）：171-179.

[8]Trout G R，Schmidt G R.Effect of phosphate type and concentration，salt level and method of preparation on binding in restructured beef rounds[J].Journal of Food Science，1984，49（3）：687-694

[9]魏朝貴，吳菊清，邵俊花，等.KCl和MgCl2部分替代NaCl對豬肉肌原纖維蛋白乳化凝膠特性的影響[J].食品科學(xué)，2014，35（5）：89-95.

[10]Youssef M K，Barbut S，Smith A.Effects of pre-emulsifying fat/oil on meat batter stability，texture and microstructure[J]. International Journal of Food Science&Technology，2011，46（6）：1216-1224.

[11]李瑋鋒，王鵬，徐幸蓮，等.血漿蛋白乳化物在低脂乳化腸中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技，2013，34（3）：288-292.

[12]Barbut S.Improtance of fat emulsification and protein matrix characteristic in meat batter stability[J].Journal of Muscle Foods，1995，6（2）：161-167.

[13]Horita C N，Morgano M A，Celeghoini R M S，et al.Physicochemical and sensory properties of reduced-fat mortadella prepared with blends of calcium，magnesium and potassium chloride as partial substitutes for sodium chloride[J].Meat Science，2011，89（4）：426-433.

[14]Caceres E，Garcia M L，Selgas M D.Effect of pre-emulsified fish oil-as source of PUFA n-3-on microstructure and sensory properties of mortadella，a Spanish bologna-type sausage[J]. Meat Science，2008，80（2）：181-193.

Research of high-quality fermentation starter of yak“Qula”in pastoral areas

WANG Lin-lin1，WANG Jun1，HAN Ling1，*，WEN Peng-cheng1，DINGKAO Ren-qing2
（1.College of Food Science and Engineering，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Gan nan Institute of Animal Science and Veterinary，Hezuo 747000，China）

Skim yak milk as the research material，titratable acidity as review indicator，with three strong fermentability lactic acid bacteria including Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus（MGD1-3），Streptococcus thermophilus（MGB39-5），Lactobacillus plantarum（BM5152）were researched and selected the best inoculation amount in skim yak milk.Three parameters were optimized by response surface central rotating composite design for process optimization.Finally，the mathematical model of each parameter was set up and these response values were analysed.The result showed that the influencing factors on titratable acidity of skim yak milk were MGD1-3＞MGB39-5＞BM5152 at 42℃and fermentation lasted for 3.5h.The best inoculation amount of MGD1-3，MGB39-5，BM5152 was 5.29，7.18，6.30lgcfu/mL respectively，and the titratable acidity was 71.90°T. Inoculated equal optimized combination starter and bacteria-containing whey liquid from pastoral areas to verify test，the result showed that the fermentation time significantly was decreased to 8.7h（p＜0.01），titratable acidity went up to 3.97°T（p＜0.05）and the viable count significantly was increased to 7.9×107cfu/mL（p＜0.01）.

Qula；lactobacillus；high-quality fermentation agent；corresponding surface design

TS201.3

A

1002-0306（2014）12-0152-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.024

2013－10－08 *通訊聯(lián)系人

王琳琳（1988-），女，碩士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品加工及貯藏。

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項經(jīng)費項目（201303085）。