哈茨木霉產水解熱凝膠的內切β-1，3-葡聚糖酶的分離純化

徐　敏，李　晶，鄭志永，朱　莉，詹曉北，，*，李　珊，張洪濤（1.江南大學生物工程學院糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇無錫214125）

哈茨木霉產水解熱凝膠的內切β-1，3-葡聚糖酶的分離純化

徐敏1，2，李晶1，2，鄭志永1，2，朱莉3，詹曉北1，2，3，*，李珊1，2，張洪濤1，2
（1.江南大學生物工程學院糖化學與生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；3.江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇無錫214125）

結合多種分離方法，從哈茨木霉（Trichoderma harzianum Rifai ACCC30371）的發酵產物中分離得到一種對不溶性多糖熱凝膠具有較高水解活性的內切β-1，3-葡聚糖酶。結果表明，哈茨木霉發酵液經50%飽和度硫酸銨沉淀預處理后，依次經過HiPrep 26/10 desalting層析柱脫鹽、QFF陰離子交換層析柱去除雜質蛋白，最終經Superdex 75凝膠柱純化獲得純度較高的內切β-1，3-葡聚糖酶。最終酶活回收率為6.63%，內切酶比酶活由6.86U/mg提高到133.01U/mg，純化倍數達到19.39倍。MALDI-TOF-TOF鑒定結果表明，該內切酶與產自綠色木霉的endoglucanase存在較高的同源性。

哈茨木霉，β-1，3-葡聚糖內切酶，熱凝膠，分離純化

β-1，3-葡聚寡糖作為一類重要的生理活性物質，其應用范圍逐漸擴大[1-2]。例如β-1，3-葡聚寡糖可以通過刺激宿主免疫功能、激活巨噬細胞、中性粒細胞和天然殺傷細胞而具有抗菌抗腫瘤活性[3-6]。目前水解具有β-1，3-糖苷鍵的葡多糖是制備β-1，3-葡聚寡糖的主要方法。而以專一性內切酶降解多糖制備相應寡糖具有水解條件溫和、操作簡便、高效等優點，是當前研究和應用的熱點。內切β-1，3-葡聚糖酶（EC3.2.1.6或EC3.2.1.39）能夠沿分子鏈隨機切割β-1，3-糖苷鍵，釋放出小分子量寡糖（DP 2-10）。同時該類酶來源廣泛，植物、真菌以及細菌中均有發現。因此，通過內切β-1，3-葡聚糖酶降解β-1，3-葡聚糖獲取相應寡糖是一種較為理想的方法。除此之外，β-1，3-葡聚糖酶在細胞融合和轉化、原生質體制備、食品加工、藥物篩選、飼料工業和發酵工業生產方面也有著巨大的潛在應用[7]。

熱凝膠是一種由土壤桿菌（Agrobacterium sp.）合成的線性無支鏈胞外β-1，3-葡聚糖，被廣泛應用于食品、化妝品等領域。因而熱凝膠可以作為安全的生產β-1，3-葡聚寡糖的原料。研究表明，哈茨木霉（Trichoderma harzianum）發酵產物中存在多種β-1，3-葡聚糖酶[8-12]，但能夠利用熱凝膠作為水解底物的內切β-1，3-葡聚糖酶鮮有報道[13]。

本研究選取以熱凝膠為主要碳源的哈茨木霉（T.harzianumRifai ACCC 30371）發酵液，依次經過硫酸銨沉淀預處理、分子篩層析除雜質、陰離子交換層析初步分離以及分子篩層析純化等操作，獲得了純度較高的具有顯著水解熱凝膠活性的內切β-1，3-葡聚糖酶。本研究可以為熱凝膠處理及內切β-1，3-葡聚糖酶純化等工業放大問題提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

哈茨木霉（T.harzianumRifai ACCC 30371）菌種由江南大學糖化學與生物技術教育部重點實驗室保藏；種子培養基（g/L） 葡萄糖15，酵母粉20，硫酸銨2.5，磷酸二氫鉀6，硫酸鎂0.8，氯化鈣1，pH6.0；發酵培養基（g/L） 熱凝膠25，葡萄糖5，硝酸鈉9，胰蛋白胨1，磷酸二氫鉀20，七水硫酸鎂0.3，氯化鈣0.4，pH6.0；熱凝膠（Curdlan） 購于Takeda-Kirin Food Co.（日本）；其余試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司（上海）。

Silica gel 60 F254層析板購自Merck KGaA，（德國）；CS-9301PC雙波長飛點掃描薄層分析儀Shimadzu Corp.，日本；JYSCZ2+凝膠電泳儀北京君意東方電泳設備有限公司；陰離子交換層析與體積排阻層析系統均采用?KTA AvantGE Healthcare Bio-Sciences AB，瑞典；層析柱為HiPrep 26/10 Desalting、HiTrap Q FF、Superdex 75 10/300 GL瑞典。

1.2實驗方法

1.2.1蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G250染色法測定，以牛血清白蛋白（BSA）為標準蛋白繪制標準曲線。

1.2.2內切酶酶活的測定取一定量的酶液加入到0.5mL 10g/L的熱凝膠底物（25mmol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液配制）中，酶與底物質量比為1∶200，用緩沖液補足體積，使得終反應體積為1mL，50℃反應3h，沸水浴煮沸10min終止反應。寡糖含量（DP2-5）可由TLC薄層層析法[14]結合雙波長飛點掃描儀進行半定量檢測，精確定量根據HPLC利用Click Maltose柱分析寡糖含量。

將每小時催化水解熱凝膠后獲得1mg寡糖（DP2-5）所需酶的量定義為一個內切酶酶活單位（U）。

1.2.3粗酶液的制備將哈茨木霉菌株以5%（v/v）接種量接種于發酵培養基，于25℃，105r/min振蕩培養6d。發酵結束后，首先經8層紗布過濾發酵液得到濾液，然后濾液于8000r/min離心15min，上清液即為粗酶液。然后于-20℃冷凍保存備用。

1.2.4硫酸銨沉淀粗分離蛋白緩慢加入一定量硫酸銨至設定飽和度，然后用稀H2SO4或氨水調節pH至設定值，并于4℃靜置過夜使蛋白充分沉淀，然后處理液于4℃，8000×g離心15min。最后以去離子水復溶沉淀至一定濃度溶液，并于-20℃冷凍保存備用。

1.2.5內切β-1，3-葡聚糖酶的純化

1.2.5.1脫鹽柱層析取濃縮的粗酶液，以水作為流動相，流速2.5mL/min，進樣量為20mL，經HiPrep 26/10 desalting層析柱脫鹽，除去小分子雜質。

1.2.5.2陰離子交換層析采用?KTA Avant蛋白純化系統對脫鹽處理后的上述酶液進行AEC分離。先以20mmol/L pH8.0的PBS緩沖液平衡層析住，流速為1mL/min。然后進樣1mL，進樣后先平衡兩個柱體積，再以1mol/L NaCl溶液進行等度洗脫，收集每個峰測定酶活，將有酶活力的組分進行凍干濃縮。

1.2.5.3體積排阻層析AEC洗脫得到的活性組分0.5mL上樣于G75凝膠過濾層析柱，洗脫液為含0.1mol/L NaCl的20mmol/L pH7.0的PBS緩沖液，流速為0.5mL/min，每1mL收集測定酶活，收集有酶活的組分，進行超濾脫鹽，凍干濃縮。

1.2.6蛋白質SDS-PAGE分析及MALDI-TOF-TOF質譜鑒定使用不連續垂直電泳系統，對分離純化的β-1，3-葡聚糖內切酶進行分析。分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，電泳采用pH8.3的Tris-HCl緩沖體系。電泳后考馬斯亮蘭R250進行染色分析。將純化出的單一蛋白條帶進行切膠，MALDI-TOF-TOF鑒定。

2　結果與分析

2.1硫酸銨沉淀預處理哈茨木霉發酵液

2.1.1pH和溫度對硫酸銨沉淀效果的影響隨著溫度改變，一定飽和度的硫酸銨溶液中硫酸銨質量分數會隨之改變，且發酵液中蛋白質在不同pH條件下的電荷狀態存在差異，為此，首先考察了pH和溫度對硫酸銨沉淀效果的影響。

表1　pH對硫酸銨沉淀蛋白效果的影響Table 1　Effect of pH on the precipitation of proteins with ammonium sulfate

表2　溫度對硫酸銨沉淀蛋白效果的影響Table 2　Effect of temperature on the precipitation of proteins with ammonium sulfate

選擇20%飽和度的硫酸銨溶液，在pH5.3～8.3，4～25℃范圍內，將哈茨木霉發酵液經硫酸銨沉淀后，對蛋白回收率、回收蛋白β-葡聚糖酶活力、水解產物中寡糖含量、寡糖占總糖比例等指標進行了測定。結果見表1和表2，在上述pH和溫度范圍內，各項測定指標間均無顯著差異。說明在較溫和條件下（pH5.3～ 8.3，4～25℃），硫酸銨沉淀提取目標蛋白（內切β-1，3-葡聚糖酶）不受pH和溫度影響。

2.1.2硫酸銨飽和度對獲取目標蛋白的影響哈茨木霉發酵液經不同飽和度硫酸銨溶液沉淀后結果差異明顯（圖1）。由圖1可知，當硫酸銨飽和度為30%時，回收后蛋白表現出較高的內切β-1，3-葡聚糖酶活性，熱凝膠水解液中寡糖濃度（DP 2-5）達到1.3g/L，在總糖中所占比例達到最高，為74%。當硫酸銨飽和度提高至40%時，水解液中寡糖含量明顯降低，而單糖所占比例增加到幾乎50%。隨著硫酸銨飽和度的進一步升高，熱凝膠水解液中總糖濃度逐漸下降，可能原因是雜質蛋白在較高硫酸銨飽和度時逐漸析出，降低了目標蛋白在蛋白沉淀中所占的比例（圖2，蛋白回收率隨著硫酸銨飽和度提高顯著增加）。由此可見，低硫酸銨飽和度有利于內切β-1，3-葡聚糖酶活性的富集。

圖1　不同硫酸銨飽和度沉淀蛋白水解熱凝膠得到的寡糖分析Fig.1　Results of degrading curdlan to oligosaccharide by different ammonium sulfate saturation on protein extraction

圖2　不同硫酸銨飽和度沉淀所得到的蛋白酶活分析Fig.2　Influence of ammonium sulfate saturation on enzyme activity

盡管降低硫酸銨飽和度對目標蛋白提取有利，但是蛋白回收率和總酶活回收率均明顯偏低（圖2）。綜合考慮總酶活回收率、比酶活提高倍數、大規模生產的操作成本等幾方面因素，選擇硫酸銨飽和度為50%較為適宜。在此條件下，總酶活回收率達到63.42%，內切酶比酶活比發酵液提高33%。

2.2陰離子交換與分子篩層析結合純化內切β-1，3-葡聚糖酶

2.2.1雜質組分的初步去除哈茨木霉發酵液經硫酸銨沉淀處理后，復溶樣品中含有的無機鹽及多肽等雜質會對后續分離產生干擾，因此首先采用分子篩層析方法對復溶蛋白樣品進行初步純化。選擇HiPrep 26/10 desalting色譜柱（MWCO=5000u），以去離子水為洗脫劑，流速2.50mL/min時的樣品洗脫曲線見圖3。測定結果表明，在該分離條件下，蛋白組分（圖3，P1）與雜質分子實現了較好的分離，P1組分可用于后續純化操作。

圖3　HiPrep 26/10 desalting脫鹽柱脫鹽曲線Fig.3　Chromatography of protein by HiPrep 26/10 desalting

2.2.2內切β-1，3-葡聚糖酶的純化隨后，采用離子交換層析方法對除去雜質的蛋白組分（圖3，P1）進一步純化，條件優化后發現，在pH8.0時，采用陰離子交換層析柱對目標蛋白實現了較好的分離。圖4為采用HiTrap Q FF陰離子交換層析柱獲得的洗脫曲線，按峰收集組分。經酶活測定發現，水解熱凝膠活性集中在P1區域（穿透峰），P2區域（吸附蛋白峰）未檢測到水解活性。表明目標蛋白未與層析填料產生吸附作用，此時穿透峰與吸附蛋白峰明顯分離，且無機鹽濃度較低，有利于后續操作進行，同時，較為簡便的階段洗脫方法更利于實現工業化放大。

圖4　HiTrap Q FF陰離子交換洗脫曲線Fig.4　Chromatography of protein by HiTrap Q FF

然后，采用分子篩層析方法對目標蛋白峰（圖4，P1）進一步純化。選擇Superdex 75 10/300 GL色譜柱，經條件優化后得到了較為理想的分離效果（圖5，圖6）。經蛋白濃度測定，洗脫后蛋白集中在峰1～4（圖5），其余均為非蛋白峰。然后，采用薄層層析法（TLC）對峰1～4水解熱凝膠產物進行了分析。結果表明，峰2（11～13mL）表現出外切酶活性，峰4（15～ 17mL）表現出了明顯的內切β-1，3-葡聚糖酶活性（圖6，Lane 3）。由于內切酶是隨機切割β-1，3糖苷鍵，因此水解得到的并不都是寡糖，有少量的單糖。

圖5　Superdex 75 10/300 GL凝膠柱洗脫曲線Fig.5　Chromatography of protein by Superdex 75 10/300 GL

圖6　不同純化階段蛋白樣品水解熱凝膠產物的TLC鑒定圖譜Fig.6　TLC analysis of curdlan hydrolyzates by protein samples at different purification steps

圖7　內切β-1，3-葡聚糖酶純化過程SDS-PAGE圖譜Fig.7　SDS-PAGE results of proteins during the purification of endo-β-1,3-glucanase

圖7為內切β-1，3-葡聚糖酶分離各步驟的SDSPAGE電泳圖譜。由圖7可知，經過硫酸銨沉淀預處理、分子篩層析除雜質、陰離子交換層析初步分離以及分子篩層析純化等一系列操作后，最終獲得了單一條帶的內切β-1，3-葡聚糖酶產品（MW=73.6ku）。最終蛋白回收率為6.63%，比酶活達到133.01U/mg，純化19.39倍（表3）。為獲得電泳純度較高的蛋白，分子篩層析只收集了峰4的峰尖2mL，因此最終酶活回收率偏低。

2.2.3純化后內切β-1，3-葡聚糖酶的鑒定為進一步考察純化后內切β-1，3-葡聚糖酶的性質，采用MALDI-TOF-TOF二級質譜對純化后蛋白序列進行了分析。通過與NCBI non-redundant protein sequences中的已知蛋白序列進行比對，發現與產自綠色木霉（Trichoderma virens）中的endoglucanase（GenBank no. ABO93399.2）存在較高的同源性，匹配分值為181分。該蛋白分子量81ku，等電點6.4，均與本研究純化得到的內切β-1，3-葡聚糖酶接近。

圖8　純化后內切β-1，3-葡聚糖酶與endoglucanase（GenBank no.ABO93399.2）序列比對結果Fig.8　Sequence alignment between the purified endo-β-1，3-glucanase and endoglucanase（from Trichoderma virens，GenBank no.ABO93399.2）

3　結論

本研究建立了從哈茨木霉（T.harzianum Rifai ACCC30371）發酵液中獲取可以降解熱凝膠的內切β-1，3-葡聚糖酶的純化方法，并且結合定量薄層層析法以水解液中寡糖濃度代替總糖濃度用以評價內切酶活性。結果表明，發酵液經過硫酸銨沉淀預處理、分子篩層析除雜質、陰離子交換層析初步分離以及分子篩層析純化等操作后，最終獲得了純度較高的內切β-1，3-葡聚糖酶。經測定，內切酶分子量73.6ku，最終純化19.39倍。該蛋白與產自綠色木霉（Trichoderma virens）的endoglucanase蛋白具有較高的同源性。

表3　內切β-1，3-葡聚糖酶純化數據匯總Table 3　Summary of purification of the endo-β-1，3-glucanase from T.harzianum Rifai ACCC30371

[1]Zhan X B，Lin C C，Zhang H T.Recent advances in curdlan biosynthesis，biotech nological production，and applications[J].Applied microbiology and biotechnology，2012，93（2）：525-531.

[2]Li J，Zhu L，Zheng Z Y，et al.A new effective process for productionofcurdlanoligosaccharidesbasedonalkalineutralization treatment and acid hydrolysis of curdlan particles in water suspension[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（19）：8495-8503.

[3]Kondori N，Edebo L，Mattsby-Baltzer I.A novel monoclonal antibody recognizing β（1-3）glucans in intact cells of Candida and Cryptococcus[J].APMIS，2008，116（10）：867-876.

[4]Torosantucci A，Chiani P，Bromuro C，et al.Protection by anti-β-glucan antibodies is associated with restricted β-1，3 glucan binding specificity and inhibition of fungal growth and adherence[J].PLoS One，2009，4（4）：e5392.

[5]Taylor P R，Tsoni S V，Willment J A，et al.Dectin-1 is required for β-glucan recognition and control of fungal infection [J].Nature Immunology，2006，8（1）：31-38.

[6]Jamois F，Ferrières V，Guégan J P，et al.Glucan-like synthetic oligosaccharides：iterative synthesis of linear oligo-β-（1，3）-glucans and immunostimulatory effects[J].Glycobiology，2005，15（4）：393-407.

[7]唐治玉.木霉β-1，3-葡聚糖酶的分離純化，性質和部分結構研究[D].武漢：華中農業大學，2006.

[8]楊勇.黃藍狀菌Talaromyces flavus內切β-1，3-葡聚糖酶的純化，特性及抗菌活性[D].泰安：山東農業大學，2003.

[9]De La Cruz J，Pintor-Toro J A，Benitez T，et al.A novel endobeta-1，3-glucanase，BGN13.1，involved in the mycoparasitism of Trichoderma harzianum[J].Journal of Bacteriology，1995，177（23）：6937-6945.

[10]Thrane C，Tronsmo A，Jensen D F.Endo-1，3-β-glucanase and cellulase from Trichoderma harzianum：purification and partialcharacterization，inductionofandbiologicalactivity against plant pathogenic Pythium spp[J].European Journal of Plant Pathology，1997，103（4）：331-344.

[11]Tangarone B，Royer J C，Nakas J P.Purification and Characterization of an Endo-（1，3）-β-d-Glucanase from Trichodermalongibrachiatum[J].AppliedandEnvironmental Microbiology，1989，55（1）：177-184.

[12]Noronha E F，Ulhoa C J.Purification and characterization of an endo-β-1，3-glucanase from Trichoderma harzianum[J]. Canadian Journal of Microbiology，1996，42（10）：1039-1044.

[13]Grandpierre C，Janssen H G，Laroche C，et al.Enzymatic and chemical degradation of curdlan targeting the production of β-（1→3）oligoglucans[J].Carbohydrate Polymers，2008，71（2）：277-286.

[14]劉芳，楊瑞金，張文斌，等.薄層色譜法快速分析乳果糖[J].食品與發酵工業，2008，34（1）：119-123.

Purification of an endo-β-1，3-glucanase to degrade curdlan from Trichoderma harzianum

XU Min1，2，LI Jing1，2，ZHENG Zhi-yong1，2，ZHU Li3，ZHAN Xiao-bei1，2，3，*，LI Shan1，2，ZHANG Hong-tao1，2
（1.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology of Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Jiangsu Rayguang Biotechnology Co.，Ltd.，Wuxi 214125，China）

In combination with a variety of purification methods，an endo-β-1，3-glucanase was separated from Trichoderma harzianum fermentation broth，which had high hydrolysis activity to insoluble polysaccharide curdlan.The purification process was carried out sequentially as follows，50%ammonium sulfate precipitation from cell culture supernate，HiPrep 26/10 desalting gel chromatography，removing impurities protein by QFF anion exchange column，finally was purified by Superdex 75 gel chromatography.The enzyme activity yield was 6.63%.The purification scheme resulted in an increase in the specific activity（from 6.86 to 133.01U/mg）and a 19.39-fold purification of endo-β-1，3-glucanase relative to the crude broth.Identified by MALDITOF-TOF，the result showed that the purified enzyme had high homology with the endoglucanase from Trichoderma virens.

Trichoderma harzianum；endo-β-1，3-glucanase；curdlan；purification

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.025

2013－11－07*通訊聯系人

徐敏（1988-），女，碩士研究生，研究方向：蛋白純化與功能性寡糖制備。

國家自然科學基金（31171640，31201384，31271888）；無錫市科技支撐計劃（農業）（CLE01N1208）；無錫市生物農業領軍型創業人才計劃（“130”計劃）。