高產大豆異黃酮糖苷轉化酶乳酸菌的篩選及其發酵條件的優化

翟清燕，趙龍玉，趙鳳春，楊正友（山東農業大學生命科學學院微生物系，農業微生物重點實驗室，山東泰安271018）

高產大豆異黃酮糖苷轉化酶乳酸菌的篩選及其發酵條件的優化

翟清燕，趙龍玉，趙鳳春，楊正友*
（山東農業大學生命科學學院微生物系，農業微生物重點實驗室，山東泰安271018）

采用高效液相色譜法測定發酵豆乳中游離型大豆異黃酮含量，以此為指標，從傳統發酵食品分離篩選的100株乳酸菌中，選出一株發酵后游離型大豆異黃酮產量最高的作為生產功能性發酵豆乳的發酵菌株。經生理生化及遺傳學特性鑒定該菌株為植物乳桿菌。并通過單因素和響應面優化實驗對影響游離型大豆異黃酮產量的3個發酵因素，即發酵時間、發酵溫度、接種量，進行優化，得出最佳發酵條件為：發酵溫度45℃、發酵時間17h、接種量5%，在此條件下游離型異黃酮的產量為132.814μg/mL。

發酵豆乳，游離型大豆異黃酮，植物乳桿菌，發酵優化

大豆是一種營養豐富的植物蛋白資源，富含人體必需的氨基酸和脂肪酸，以及人體生理代謝過程中所需的多種生物活性物質，如大豆異黃酮（Iso）、低聚糖、降壓肽、γ-氨基丁酸等。其中大豆異黃酮是大豆在生長過程中形成的一種次生代謝產物，含量約為0.1%～0.5%[1]，由于其結構與動物雌激素相似，素有植物雌激素的美稱，而且具有類似雌激素的生理功能，如抗腫瘤、緩解更年期癥狀、降血壓、降血脂和心血管疾病發病率等[2-3]。

目前已研究發現的大豆異黃酮共有12種，包括3種游離型苷元結構（大豆苷元，染料木素，大豆黃素，占2%～3%）和9種結合型糖苷結構（占97%～98%）[4]。研究表明，大豆異黃酮苷元型的生物活性比其相應糖苷要高，能夠直接被小腸上皮細胞吸收，是人體可以利用的有效形式，但90%以上的大豆異黃酮均以糖苷形式存在，因此，天然大豆及其產品中大豆異黃酮的生物活性一般比較低。

近年來，國內外研究發現β-葡萄糖苷酶能夠將大豆異黃酮結構中的β-O-糖苷鍵水解使糖苷型異黃酮轉化為苷元形式，從而提高大豆制品中異黃酮的生物有效性。β-葡萄糖苷酶廣泛存在于植物以及一些酵母、霉菌和細菌體內，一些研究發現乳酸菌中普遍含有β-葡萄糖苷酶，而且乳酸菌作為人體的腸道益生菌可以直接添加到食品中，經過發酵β-葡萄糖苷酶將異黃酮糖苷結構水解，轉化成的苷元形式可以直接被小腸吸收，有效促進異黃酮生物功能的發揮[5]。本研究力圖篩選高產大豆異黃酮糖苷轉化酶的益生菌來發酵豆乳，提高游離型大豆異黃酮的產量，結合大豆和乳酸菌的雙重保健作用，研制出一種風味和營養兼具的功能性發酵豆乳。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 市售；乳酸菌100株 保存于山東農業大學生命科學學院；大豆苷（Daidzin）、大豆苷元（Daidzein）、染料木苷（Genistin）、染料木素（Genistein）標準品 購于Aladdin公司；甲醇、冰乙酸 色譜純；水 去離子水。

高效液相色譜系統 美國Agilent公司；COSMOSIL 5C18-AR-Ⅱ（150mm×4.6mm） 日本Nacalai Tesque公司；超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司；高速冷凍離心機Effendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵豆乳的制備[6]大豆（無霉爛、變質）→清洗浸泡→磨漿→過濾→煮漿→分裝→殺菌（95℃，15min）→冷卻（42℃）→接種→培養。

1.2.2 高產糖苷轉化酶乳酸菌的篩選

1.2.2.1 大豆異黃酮的提取[7]發酵豆乳1mL與25mL 100%甲醇混合均勻，并置于超聲波中于50℃萃取40min，待超聲波萃取結束后離心（8000r/min，30min），取上清液用旋轉蒸發儀進行濃縮后，將剩余液體轉移到離心管中用甲醇定容至5mL，過0.22μm微孔濾膜，將濾液進高效液相色譜系統測定不同菌株發酵后游離型大豆異黃酮的含量，由此來確定最佳發酵菌株。

1.2.2.2 高效液相色譜條件 采用C18色譜柱（150mm× 4.6mm，4.5nm）；流動相：水相（0.1%冰醋酸）：有機相甲醇（0.1%冰醋酸）（5.5∶4.5）；紫外檢測波長：260nm；流速：1mL/min；進樣量：20μL；柱溫：室溫。

1.2.2.3 大豆異黃酮標準品標準曲線的繪制 根據上述色譜條件，將大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素四種標準品分別配制成0.001、0.005、0.01、0.03、0.1mg/mL 5個濃度梯度，以標準液濃度為X軸，峰面積為Y軸繪制標準曲線，得出大豆苷的回歸方程為：y=107x-15334，R2=0.9992；大豆苷元的回歸方程為：y=5×107x-20013，R2=0.999；染料木苷的回歸方程為：y=107x+5105，R2=0.9993；染料木素的回歸方程為：y= 6×107x-25716，R2=0.999。

1.2.3 菌株鑒定

1.2.3.1 形態學和生理生化鑒定 根據《伯杰細菌鑒定手冊》對篩選菌株進行形態學和生理生化特征鑒定[8]。

1.2.3.2 遺傳學鑒定[9-10]16S rDNA序列擴增和分析：采用CTAB法提取DNA作為PCR擴增的模板，PCR產物經切膠純化后與pMD18-T載體連接，將載體轉化到E·coli JM109感受態細胞中，經藍白斑篩選提取重組質粒，酶切驗證后進行測序。將測得序列提交到GenBank中進行序列對比，并用MEGA 3.1軟件以Neighbor Join法繪制系統發育樹。

1.2.4 單因素實驗[11]

1.2.4.1 發酵溫度對大豆異黃酮含量的影響 取活化好的菌液按2%（v/v）的接種量接入滅菌豆乳中，分別置于27、32、37、42、47℃的溫度條件下培養8h，分析不同溫度對大豆異黃酮含量的影響。

1.2.4.2 發酵時間對大豆異黃酮的影響 取活化好的菌液按2%（v/v）的接種量接入滅菌豆乳中，置于37℃條件下分別發酵0、4、8、12、16、20、24h，觀察不同發酵時間對大豆異黃酮含量的影響。

1.2.4.3 接種量對大豆異黃酮的影響 取活化好的菌液按1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%（v/v）的接種量接入滅菌豆乳中，置于37℃條件下發酵8h，觀察不同接種量對發酵豆乳中大豆異黃酮含量的影響。

1.2.5 Box-Behnken響應面法實驗設計[12]根據單因素實驗結果，每個自變量選取低、中、高3個實驗水平分別以箒1、0、1進行編碼（見表1），利用Design Expert 8.05軟件對實驗數據進行回歸分析，得到多元二次回歸方程，分析各因素的主效應和交互效應，從而確定最佳發酵條件。

該模型的多元二次回歸方程可以表達為：

其中Y為響應值（游離型大豆異黃酮總量），A0，Ai，Aii，Aij為方程系數，Xi，Xj（i≠j）為自變量編碼值。

表1 實驗因素水平及編碼Table 1 The coded and uncoded values of variables in Box-Behnken design

1.2.6 數據處理 本文測定的數據均為3個重復的平均值，使用SPSS 17.0軟件進行數據分析，Excle進行數據作圖。

2 結果與分析

2.1 高產糖苷轉化酶乳酸菌的篩選

將不同菌株按一定比例接入豆乳中，測定發酵后各樣品中大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素的含量，篩選出一株發酵后游離型大豆異黃酮（即大豆苷元和染料木素）總量最高的作為發酵菌株，并以原豆漿中各成分的含量作為對照（見表2），可知該菌株發酵后豆乳中游離型大豆異黃酮的總量大約是未發酵的8倍。大豆異黃酮標準品液相色譜圖見圖1，原豆漿液相色譜圖見圖2，發酵后的液相色譜圖見圖3。

表2 原豆乳和發酵豆乳中大豆異黃酮的濃度（μg/mL）Table 2 Concentration of soy isoflavone of soybean milk and fermented soymilk（μg/mL）

2.2 菌株鑒定

2.2.1 細菌形態學和生理生化鑒定[13]通過對不同發酵豆乳中游離型大豆異黃酮含量的測定，獲得一株高產大豆異黃酮糖苷轉化酶乳酸菌，將其命名為LP4。通過顯微鏡觀察鑒定LP4為革蘭氏陽性桿菌，無芽孢，無莢膜，菌落形態特征為圓形，表面光滑，呈乳白色，不透明，生理生化鑒定結果見表3。

圖1 大豆異黃酮標準品高效液相色譜圖Fig.1 The chromatogram of HPLC of soy isoflavone standard

圖2 原豆乳高效液相色譜圖Fig.2 The chromatogram of soybean milk

圖3 發酵豆乳高效液相色譜圖Fig.3 The chromatogram of fermented soybean milk

2.2.2 16S rDNA基因序列及遺傳學分析[14]測序得知菌株LP4的16S rDNA基因序列含有1438bp，其GenBank登錄號為KF192886。將LP4菌株的16S rDNA基因序列與GenBank中的序列進行比對，發現與Lactobacillus屬成員具有較高的序列相似性，用Neighbor Joining方法構建的系統發育樹（圖4）表明其與Lactobacillus plantarum種親緣關系密切，序列相似性達到了99%。因此，根據菌株LP4的形態特征和16S rDNA基因序列以及系統發育學分析，將菌株LP4初步鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖4 菌株LP4及相關細菌16S rDNA基因序列系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain LP4 and related strains

2.3 游離型大豆異黃酮發酵條件的優化

2.3.1 單因素實驗

2.3.1.1 發酵溫度對大豆異黃酮含量的影響 由圖5可知，游離型大豆異黃酮（大豆苷元和染料木素）的含量隨著溫度的升高逐漸增大，相反，糖苷型大豆異黃酮（大豆苷和染料木苷）的含量隨之減少。當溫度為42℃時游離型大豆異黃酮總量達到最大，溫度繼續升高，游離型大豆異黃酮的含量反而降低。這可能由于過高的溫度已不適宜菌體的生長，β-葡萄糖苷酶的活性下降，糖苷型結構不能再轉化為游離型結構。

圖5 發酵溫度對大豆異黃酮含量的影響Fig.5 Effect of fermented temperature on soy isoflavone yield

表3 LP4菌株的生理生化鑒定結果Table 3 Physiology biochemistry experiments of Lactobacillus plantarum 4

2.3.1.2 發酵時間對大豆異黃酮含量的影響 由圖6可知，隨著發酵時間的延長糖苷型大豆異黃酮（大豆苷和染料木苷）不斷水解轉化為游離型大豆異黃酮，在發酵初期，游離型大豆異黃酮的增加量較為顯著，12h以后增長開始變緩，產生這種現象的原因推測是發酵后期菌株進入生長衰退期，發酵活力有所下降，β-葡萄糖苷酶的活性也因此降低。

圖6 發酵時間對大豆異黃酮含量的影響Fig.6 Effect of fermented time on soy isoflavone yield

2.3.1.3 接種量對大豆異黃酮含量的影響 由圖7可知，當接種量較小時，豆乳中游離型大豆異黃酮的含量隨著接種量的增加而升高，而接入的菌液過多時，游離型大豆異黃酮的量反而降低，這可能是由于接種量過高，菌體在生長代謝過程中產生大量的乳酸等酸性物質，在低pH環境下會影響糖苷型結構轉化為游離型結構，而且強酸環境還可能會造成游離型結構的水解，因此，確定4%～6%為適宜的接種范圍。

圖7 接種量對大豆異黃酮含量的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on soy isoflavone yield

2.4 響應面法優化最佳發酵條件

2.4.1 實驗設計及結果 根據單因素實驗結果，采用Box-Behnken設計，以發酵溫度（A）、發酵時間（B）、接種量（C）為自變量，游離型大豆異黃酮總量（Y）為響應值，進行響應面分析，實驗結果見表4，回歸方程方差分析表見表5。

利用Design Expert軟件對表4中游離型大豆異黃酮總量的實驗數據進行多元回歸擬合，獲得游離型大豆異黃酮總量對編碼自變量發酵時間、發酵溫度、接種量的二次多項回歸方程：

Y=132.08+3.96A+3.43B+2.00C-1.24AB-0.15AC+ 0.76BC-3.20A2-5.20B2-5.79C2式（2）

模型方程回歸方差分析顯著性結果表明，該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項不顯著（p=0.9256），并且該模型的R2=0.9873，R2adj=0.9709，說明回歸方程的擬合程度良好，可靠性高，自變量和響應值之間的線性關系高度顯著，可以用于游離型大豆異黃酮含量的理論預測。

表4 Box-Behnken實驗結果Table 4 Results of Box-Behnken design

表5 回歸方程方差分析表Table 5 ANOVA for the evaluation of the quadratic model

由Box-Behnken優化實驗得到游離型大豆異黃酮最佳發酵條件為：發酵溫度44.81℃、發酵時間17.10h、接種量5.18%，在此條件下，游離型大豆異黃酮總量理論值可達133.845μg/mL。

2.4.2 響應面分析 根據回歸分析結果作出相應的3D圖，如圖8所示，當接種量為固定為5%的條件下，發酵溫度為45℃，發酵時間為16h左右時，游離型大豆異黃酮的含量達到最大值，且發酵溫度與發酵時間的交互作用達到了顯著水平。根據Yang等[15]對Pseudomonas ZD-8菌株中β-葡萄糖苷酶活性測定發現45℃時其活性可以保持穩定，當溫度達到50℃時，活性降低到原來的44%，與本研究所得結論基本一致。由圖9可知，當發酵時間固定在16h的條件下，發酵溫度與接種量對游離型大豆異黃酮的影響均很顯著，選擇一個適合乳酸菌生長的溫度及提高接種量可增加游離型大豆異黃酮的產量。同時，結合圖10和表5可以看出當發酵溫度固定在42℃時，接種量與發酵時間對游離型大豆異黃酮產量的影響顯著，且發酵時間影響的顯著性要大于接種量。微生物發酵可以發揮β-葡萄糖苷酶的作用，使異黃酮糖苷型結構向生物活性更高的游離型結構轉化，而隨著發酵時間的延長，微生物的生長速率減慢，β-葡萄糖苷酶的活性也隨之下降。

2.4.3 模型的驗證 考慮到操作的方便性，將最佳條件調整為：發酵溫度45℃，發酵時間17h，接種量5%，在此條件下，測得的游離型大豆異黃酮總量為132.814μg/mL，稍低于預測值133.649μg/mL，模型預測值與實測值較為吻合，說明該模型可以較好的反映游離型大豆異黃酮的最佳發酵條件。

圖8 發酵溫度與發酵時間對游離型大豆異黃酮總量的影響Fig.8 3D ional plot of soy isoflavone aglycones at different fermentation time and temperature

圖9 接種量與發酵溫度對游離型大豆異黃酮總量的影響Fig.9 3D ional plot of soy isoflavone aglycones at different inoculation amount and fermentation temperature

圖10 接種量與發酵時間對游離型大豆異黃酮總量的影響Fig.10 3D ional plot of soy isoflavone aglycones at different inoculation amount and fermentation time

3 結論

本研究通過HPLC法測定發酵豆乳中游離型大豆異黃酮含量，從中篩選出一株高產大豆異黃酮糖苷轉化酶菌株作為生產功能性發酵豆乳的發酵菌株，經生理生化及遺傳學特性鑒定其為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。以游離型大豆異黃酮含量為指標，在單因素實驗的基礎上采用3因素3水平的響應面分析法，得出最佳發酵條件為：發酵溫度45℃、發酵時間17h、接種量5%，在此條件下游離大豆異黃酮的含量可達到132.814μg/mL。本研究結果顯示利用該菌株發酵豆乳具備明顯的開發潛力和優勢，大大提高了大豆制品中異黃酮的生物有效性，為今后發酵豆制品的研發提供了必要的理論依據和技術支持。

[1]劉肖南，馬艷莉，韭澤悟，等.高效液相色譜法測定六種大豆異黃酮及雌馬酚的含量[J].中國食物與營養，2012，18（9）：58-61.

[2]范紅艷，顧饒勝，王艷春，等.大豆異黃酮抗衰老作用研究[J].中草藥，2010，41（9）：2054-2057.

[3]Messina M，Erdman J，Setchell K D R.Introduction to and perspectives from the fifth international symposium on the role of soy in preventing and treating chronic disease[J].The Journal of Nutrition，2004，134：1205-1206.

[4]Jiyeon Chun，Jong Sang Kim，Jeong Hwan Kim，et al. Enrichment of isoflavone aglycones in soymilk by fermentation with single and mixed cultures of Streptococcus infantarius 12 and Weissella sp.4[J].Food Chemistry，2008，109：278-284.

[5]OtienoD O，Ashton JF，ShahN P.Isoflavone phytoestrogen degradation in fermented soymilk with selected β-glucosidase producing Lacidophilusstrainsduring storage atdifferent temperatures[J].International Journal of Food Microbiology，2007，115（1）：79-88.

[6]馬成杰，杜紹平，華寶珍.植物乳桿菌ST-Ⅲ在豆乳中的發酵特性及發酵豆乳的貯藏穩定性[J].食品科學，2013，34（5）：151-155.

[7]宋冰，王丕武，張秀艷，等.大豆異黃酮提取工藝的優化[J].大豆科學，2008，27（2）：343-346.

[8]布坎南·O·R·E，吉本斯·N·F.伯杰細菌鑒定手冊[M].第八版.中國科學院微生物研究所譯.北京：科學出版社，1984.

[9]陳海英，林健榮，宋家清，等.CP7菌株的抗菌活性及菌種鑒定[J].中國生物防治，2007，23（增刊）：16-21.

[10]于國萍，孟憲金.乳酸菌發酵法水解大豆異黃酮[J].食品科學，2009，30（17）：217-220.

[11]楊志巖，尹樹花，白明，等.油松花粉中總黃酮提取的響應面優化[J].現代食品科技，2008，24（3）：253-256.

[12]都立輝，劉芳.16S rRNA基因在細菌菌種鑒定中的應用[J].乳業科學與技術，2007（5）：207-209.

[13]劉佩，周倩，沈生榮，等.產共軛亞油酸植物乳桿菌的篩選、鑒定與誘變[J].食品科學，2010，31（9）：135-139.

[14]Xia Chen，Xiaohua Du，Weihong Wang.Isolation and identification of cultivable lactic acid bacteria in traditional fermented milk of Tibet in China[J].International Journal of Dairy Technology，2010，63（3）：437-444.

[15]Yang L，Ning Z S，Shi C Z，et al.Purification and characterization of an isoflavone conjugates hydrolyzing βglucosidase from endophytic bacterium[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（7）：1940-1944.

Isolation and identification of high-yield soy isoflavone glycosidase of lactic acid bacteria and optimization of fermentation conditions

ZHAI Qing-yan，ZHAO Long-yu，ZHAO Feng-chun，YANG Zheng-you*
（Department of Microbiology，College of Life Science，Key Laboratory for Agriculture Microbiology，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China）

For production of functional fermented soymilk，one strain was selected from one hundred lactic acid bacteria isolates based on their capacities to hydrolyze isoflavone glucosides to aglycones by high performance liquid chromatography（HPLC）.Based on the biochemistry and genetic characteristics analysis，the strain was classified as Lactobacillus plantarum.Fermentation conditions including fermentation time，temperature and inoculum amount were optimized by one-factor-at-a-time and response surface methodology（RSM）.The optimum fermentation condition as follows：fermentation for 17h at 45℃with inoculation amount of 5%，while the soy isoflavone aglycones production was 132.814μg/mL.

fermented soymilk；soy isoflavone aglycones；Lactobacillus plantarum；fermentation optimization

TS201.3

A

1002-0306（2014）12-0162-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.026

2014－01－14 *通訊聯系人

翟清燕（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物。

國家自然科學基金（30972050，31271873）；山東省自然科學基金（ZR2010CM015）。