酶解牦牛肉粉的制備工藝研究

謝貞建，唐遠謀，王 超，張坤瓊，唐仁勇，王 衛，*（.成都大學肉類加工四川省重點實驗室，四川成都6006；.成都大學金牛校區管委會，四川成都6008；.成都大學生物產業學院，四川成都6006）

酶解牦牛肉粉的制備工藝研究

謝貞建1，3，唐遠謀2，王 超3，張坤瓊3，唐仁勇1，王 衛1，3，*
（1.成都大學肉類加工四川省重點實驗室，四川成都610106；
2.成都大學金牛校區管委會，四川成都610083；3.成都大學生物產業學院，四川成都610106）

目的：研究牦牛肉酶解工藝最佳參數，制備牦牛肉蛋白粉。方法：在單因素實驗基礎上，運用響應面設計對牦牛肉酶解工藝參數進行優化。結果：最佳酶解工藝為酶濃度1600IU/g、料液比1∶6（g∶mL）、pH9、溫度55℃，水解5h。在此條件下水解度達19.01%，水解液經噴霧干燥得到香味濃郁的淺黃色粉末。結論：響應面法確定的酶解條件合理，實驗驗證值與預測值接近，該工藝條件可用于酶解牦牛肉粉的制備。

酶解，牦牛肉粉，水解度，響應面設計

牦牛（Bos grunniens），是一種生活在青藏高原的長毛的牛屬動物，與北極熊、企鵝共稱為“世界三大高寒動物”，具有極強的抗逆力、抗病能力、耐受性和適應性。我國是世界上擁有牦牛頭數最多的國家，約占全世界的90%[1]。《呂氏春秋》載“肉之美者，牦象之肉”，牦牛肉被譽為“牛肉之冠”，屬半野生天然綠色食品，富含蛋白質和氨基酸，鐵、鈣等微量元素。目前人們對牦牛肉的利用還主要局限于制作牦牛肉干等肉制品，對其進行深加工還亟待加強。

酶解動物蛋白水解后生成許多小肽和氨基酸，有利于人體吸收，提高蛋白質的生物利用率，而且小肽具有許多保健功能[2]，同時也是現代肉味香精制造的關鍵技術[3]。對于水解動物蛋白制備高附加值生物產品一直受到研究工作者的關注。動物蛋白水解通過美拉德反應得到獨特的風味，制造肉味香精是眾多學者研究的熱點[4]。近年來，利用動物蛋白酶解制備活性多肽受到越來越多學者的關注。對烏賊[5]、紫河車[6]、扇貝[7]、鯊魚、毛蝦[8]等動物蛋白酶解液的研究顯示其具有較強的抗氧化、清除自由基的功能。本文通過選擇合適的酶，對牦牛肉酶解工藝進行研究，水解液經噴霧干燥制得牦牛肉粉，為牦牛肉的深加工提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牦牛肉 購于四川省阿壩州；木瓜蛋白酶（1000IU/mg，批號：126928）、堿性蛋白酶（100IU/mg，批號：12122） 如吉生物科技；酸性蛋白酶（50000IU/mg，批號：01-121） 北京奧博星生物；枯草桿菌蛋白酶（1500IU/mg，批號：M0036） kayon生物；其余試劑 均為國產分析純；所用蒸餾水 無離子雙蒸餾水。

AA-6800原子吸收分光光度計 日本島津；分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；B-290噴霧干燥設備 瑞士BUCHI mini spray dryer；TH2-C恒溫振蕩器 江蘇太倉實驗設備廠；CT14D臺式離心機 天美科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牦牛肉原料一般營養成分分析 水分采用GB 5009.3-2010《食品安全國家標準食品中水分的測定》中直接干燥法[9]；蛋白質采用GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法[10]；脂肪采用GB/T 9695.7-2008《肉與肉制品總脂肪含量測定》索氏抽提法[11]；總糖采用GB/T 9695.31-2008《肉制品總糖含量測定》中直接滴定法[12]；鐵、鋅的測定采用原子吸收分光光度法[13-14]。

1.2.2 酶解工藝 牦牛肉→清洗絞碎→勻漿→調節pH→加蛋白酶保溫酶解→90℃水浴10min滅酶→冷卻至室溫→3000r/min離心10min→噴霧干燥→酶解牦牛肉粉。

1.2.3 蛋白酶的選擇 選用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶作為牦牛肉水解用酶，各酶用量均為1000IU/g原料，料液比1∶5（g∶mL），分別在pH6.0、10.0、3.0、7.5下55℃水解5h。

1.2.4 單因素實驗設計 在pH=10，料液比1∶5（g∶mL），55℃水解5h條件下，測定加酶量分別為800、1000、1200、1600、2000、2400IU/g時的水解度以確定最佳酶濃度；

在pH=10，酶濃度2000IU/g，55℃水解5h條件下，測定料液比分別為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（g∶mL）下測定水解度以確定最佳料液比；

在酶濃度2000IU/g，料液比1∶5（g∶mL），pH=10，55℃條件下水解1、2、3、4、5、6h，分別測定水解度以確定最佳酶解時間；

在酶濃度2000IU/g，料液比1∶5（g∶mL），55℃條件下水解5h，分別測定pH為8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0時的水解度以確定最佳pH；

在酶濃度2000IU/g，料液比1∶5（g∶mL），pH=10條件下水解5h，分別測定45、50、55、60、65℃時的水解度，以確定最佳反應溫度。

1.2.5 響應面實驗設計 在單因素實驗結果的基礎上，選取酶濃度、料液比、初始pH、反應溫度四個因素進行四因素三水平的響應面設計，因素水平編碼見表1，反應時間定為5h。

表1 Box-Behnken實驗設計因素水平編碼表Table 1 Factors and code levels of Box-Behnken experimental design

1.2.6 分析檢測 氨基酸態氮的測定：采用甲醛電位滴定法[15]。水解度公式如下：

式中：DH—水解度，%；h0—樣品總氮含量，g/100g； h1—水解前氨基酸態氮的含量，g/100g；h2—水解后氨基酸態氮的含量，g/100g。

1.2.7 噴霧干燥[16]將酶解液在3000r/min，10min條件下離心，取上清液。直接加熱濃縮到固形物含量在12.0%左右，進行噴霧干燥，進樣溫度為160℃，出口溫度為85℃，蒸發容量為1.0L/h（以H2O計）。制備出干燥的酶解牦牛肉粉，用保鮮袋包裝，密封好，冷凍保藏。

1.3 數據分析

響應面實驗設計、數據分析及模型建立皆由Design-expert（version 7.0.0 Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN.USA）輔助完成。圖表制作由GraphPad Prism 5完成。

2 結果與分析

2.1 牦牛肉原料一般成分分析

牦牛肉的一般營養成分見表2，由表2可以看出，牦牛肉粗蛋白含量高達23.4%，脂肪和總糖含量較低。鐵含量較高，達34.5mg/kg，這可能跟牦牛為適應高海拔缺氧的生活環境有關，體內含有大量含Fe肌紅蛋白以貯存O2。鋅是人體必需的微量元素之一，在體內具有多種生理功能，人體每日所需鋅含量為12～16mg[17]，牦牛肉含鋅達39.7mg/kg，是良好的鋅補充來源。綜上，牦牛肉是一類高蛋白、低脂肪、低糖，富含鐵、鋅等微量元素的優質動物蛋白原料，符合現代營養健康理念。

表2 牦牛肉原料一般營養成分Table 2 The common nutritional ingredient of yak meat raw material

2.2 水解蛋白酶的選擇

酶解結果表明（圖1），堿性蛋白酶的水解效果最好，水解度達到13.02%，確定用堿性蛋白酶作為水解用酶。

圖1 水解蛋白酶的選擇Fig.1 The selection of proteinase

2.3 單因素酶解條件的選擇

2.3.1 酶濃度的選擇 由圖2可以看出，隨著酶濃度的增加水解度呈增長的趨勢，當達到2000IU/g后有下降趨勢。表明在2000IU/g的酶用量將可切割肽鍵基本酶解完畢，繼續增加酶用量并不能顯著提高水解度。

圖2 酶濃度對水解度的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on degree of hydrolysis

2.3.2 料液比的選擇 由圖3可以看出料液比在1∶5（g∶mL）的時候水解度明顯高于其他比例，此比例下牛肉漿流動性好，利于酶與底物的充分結合。

圖3 料液比對水解度的影響Fig.3 Effect of ratio of substrate to water on degree of hydrolysis

2.3.3 水解時間的選擇 由圖4可以看出，隨著時間的增加，水解度逐漸增大，水解至5h時增長緩慢。

圖4 水解時間對水解度的影響Fig.4 Effect of time on degree of hydrolysis

2.3.4 pH的選擇 由圖5可以看出，pH對酶的影響是很大的，當pH=10時，水解度較高。

2.3.5 反應溫度的選擇 由圖6可以發現溫度對反應的影響很大，50℃以后隨著溫度的上升，水解度有明顯下降的趨勢，酶蛋白結構和活性可能受到破壞，導致水解度下降，50℃為該體系最適宜溫度。

2.4 響應面設計及分析

圖5 pH值對水解度的影響Fig.5 Effect of pH value on degree of hydrolysis

圖6 溫度對水解度的影響Fig.6 Effect of temperature on degree of hydrolysis

相較于單因素實驗，響應面設計可以通過較少實驗次數，有效建立連續變量與指標之間的關系，同時可以考察單獨變量、變量相互之間的影響[18-19]。實驗設計及結果見表3。

對表3數據進行多元回歸擬合，修正得到水解度（Y）對酶濃度（A）、料液比（B）、pH（C）和溫度（D）的二次多項回歸模型為：

Y=14.22+0.093A+0.70B+0.51C+0.17D-0.70CD+ 1.34A2+1.35B2+0.97C2+1.21D2。

模型的方差分析見表4，由表4可知，回歸模型的F=19.10，p＜0.0001，表明模型極顯著。失擬項F=4.86，p=0.0685＞0.05，說明失擬項不顯著，表明本實驗無其他因素的顯著影響，所選的模型是適合的。決定系數R2=0.9005，表明實測值與模型預測值之間具有良好的擬合度，模型能夠很好地對實驗進行預測。校正決定系數R2adj=0.8533，說明該模型能說明85.33%的響應值[20-21]。離散系數（CV）表示實驗的精確度，其值越大，精確度越低，本實驗CV=2.84%，在可接受范圍，該模型可用于堿性蛋白酶水解牦牛肉水解度的分析與預測。

從表4可知，一次項B極顯著、C高度顯著，其余兩項不顯著；交互項CD項高度顯著；所有的二次項均極顯著。由F值可知4個因素對水解度影響大小依次為：B＞C＞D＞A，即料液比＞pH＞溫度＞酶濃度。

回歸模型中交互項CD的等高線圖如圖7所示，此等高線圖呈橢圓形，表明初始pH（C）與反應溫度（D）之間交互效應顯著[22]。沿pH軸向變化等高線變化密集，說明pH對水解度的影響比溫度的影響顯著，水解度對pH的變化比對溫度的變化敏感。

表3 響應面實驗因素水平及結果Table 3 Factors，levels and results of Response Surface Method（RSM）analysis

通過模型方程及響應面的分析，優化得到最佳酶解工藝為：酶濃度1600IU/g、料液比1∶6、pH9、溫度55℃，水解5h，預測在此條件下水解度達20.1%。經三次驗證實驗得水解度的平均值為19.01%。水解液經噴霧干燥，得淺黃色粉末。

圖7 溫度與pH交互作用對牦牛肉水解度影響的等高線圖Fig.7 Contour plot to study the effect of temperature and pH value on the degree of hydrolysis

表4 響應面模型方差分析Table 4 ANOVA for response surface model

3 結論與討論

3.1 牦牛肉原料的一般營養成分：牦牛肉含水分73.5%、脂肪3.8%、蛋白質23.4%、總糖0.02g/kg、鐵34.5mg/kg、鋅39.7mg/kg，是一種高蛋白、低脂肪、低糖，富含鐵、鋅等微量元素的優質動物蛋白。

3.2 在單因素基礎上，利用響應面設計對牦牛肉酶解工藝進行優化，建立關于水解度與酶濃度、料液比、pH、溫度四個因素的回歸模型，經驗證實驗證明該模型可行。4個因素對水解度影響大小依次為：料液比＞pH＞溫度＞酶濃度。最佳酶解工藝為：酶濃度1600IU/g、料液比1∶6（g∶mL）、pH9、溫度55℃，水解5h，在此條件下，水解度為19.01%。

3.3 在最佳酶解工藝條件下水解后，水解液經噴霧干燥得香味濃郁的淺黃色粉末，蛋白質被分解為小分子多肽或游離氨基酸，有利于人體吸收。本文為牦牛肉資源深加工提供了新的思路。

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Study on preparation of enzymatic hydrolysis Yak meat powder

XIE Zhen-jian1，3，TANG Yuan-mou2，WANG Chao3，ZHANG Kun-qiong3，TANG Ren-yong1，WANG Wei1，3，*
（1.Meat Processing Key Laboratory of Sichuan Province，Chengdu 610106，China；2.Jinniu District Governing Board of Chengdu University，Chengdu 610083，China；3.Faculty of Biotechnology Industry of Chengdu University，Chengdu 610106，China）

Object：To study the optimal conditions of enzymatic hydrolysis Yak meat and prepare the Yak meat powder.Methods：The optimal ranges of independent variables were selected on the basis of single-factor tests.Response surface methodology was adopted to evaluate the effects of reaction variables on the degree of hydrolysis.Results：The results showed that the optimal conditions for enzymatic hydrolysis were enzyme dosage 1600IU/g，the ratio of substrate to water 1∶6（g∶mL），the pH value 9，the reaction temperature 55℃，and reaction time of 5h.The actual degree of hydrolysis was 19.01%.The Yak meat powder was light yellow with the technology of spray drying.Conclusion：The obtained model was credible and could be used for the preparation of enzymatic hydrolysis Yak meat powder.

enzymatic hydrolysis；yak meat powder；degree of hydrolysis；response surface design

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0188-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.032

2013－09－02 *通訊聯系人

謝貞建（1982-），男，博士，講師，研究方向：食品營養與安全。

肉類加工四川省重點實驗室開放基金項目（13-R12）；成都大學2013年校青年基金項目（2013XJZ13）；成都大學2013年創新性實驗計劃（CDU_CX_201301137）；成都大學2013年科創杯實驗項目（2013-KC-ZRKX-24）。