固定化酵母細胞在醬油中的發酵特性研究

王 鑫，韓春然，劉曉飛，馬永強，宮安旭（哈爾濱商業大學食品工程學院省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076）

固定化酵母細胞在醬油中的發酵特性研究

王 鑫，韓春然，劉曉飛，馬永強*，宮安旭
（哈爾濱商業大學食品工程學院省高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076）

以磁性殼聚糖微球為固定化載體，對固定化酵母細胞的發酵條件進行研究，對影響酵母細胞增殖的主要因素：溫度、食鹽含量、pH進行分析，以相同時間內還原糖含量為指標，在單因素實驗的基礎上，利用響應曲面法對反應的發酵條件進行優化。結果表明：固定化酵母細胞最佳條件為溫度28.5℃，食鹽含量8%，pH6.57，還原糖含量為3.27g/mL。在最佳的發酵條件下應用固定化酵母細胞進行發酵，結果表明其可以有效的增加醬油的香氣，提高醬油品質。

固定化，發酵，醬油

固定化細胞在調味品生產領域中應用廣泛，如醬油發酵、釀醋、谷氨酸發酵、辣椒素、可樂飲料添加劑咖啡因和食用色素等[1]。醬油生產采用固定化細胞技術能使生產周期縮短，改善醬油風味。我國一般多為釀造醬油，可以分為兩大類即高鹽稀態發酵工藝醬油和低鹽固態發酵工藝醬油。若在低鹽固態發酵工藝醬油的過程中添加耐鹽酵母或加入醬醪汁，可以顯著的改善醬油味的風味，低鹽固態發酵工藝醬油中主要在后期的發酵過程中添加酵母細胞[2-3]。日本的Osaki等以海藻酸鈣為載體對利用固定化細胞生產醬油進行了研究，得到海藻凝膠、圓柱陶瓷和陶瓷顆粒等3種固定化細胞的產酸能力高于游離細胞，產品風味良好[4-6]。本文將篩選出的酵母菌細胞進行固定化，由于磁性殼聚糖微球固定化的莫格球擬酵母細胞的特殊性，故需要對其發酵的條件進一步的進行摸索，對反應中的溫度、pH、鹽度進行考察，確定最佳的發酵條件，從而提高醬油的品質，縮短生產周期。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

磁性殼聚糖微球 自制；莫格球擬酵母細胞Torulopsis mogii Vidal-Leir 工業微生物菌種保藏中心；麥芽糖、醬油 哈爾濱正陽河醬油廠提供；硫酸銅、亞甲基藍 天津市天新精細化工開發中心；酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀 天津化學試劑三廠。

BS224S電子分析天平 賽多利斯科學儀器北京有限公司；ZHWY-2102C恒溫培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司；HNY型恒溫培養振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；HD-920潔凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 磁性殼聚糖微球制備 準確稱量1g殼聚糖溶于50mL 5%的乙酸溶液中加入1g磁粉，超聲40min，溫度30℃使其充分混合。將80mL液體石蠟40℃，乳化30min，將充分混合的殼聚糖與Fe3O4磁粉溶液呈珠狀流出，緩緩滴入進入分散介質，10min后加入交聯劑，40℃攪拌2h后升溫至65℃再繼續攪拌2h。反應結束后用石油醚、丙酮、無水乙醇充分洗滌，40℃真空干燥24h，即得到磁性殼聚糖微球[7-8]。

1.2.2 醬油發酵液中還原糖的測定 采用亞鐵氰化鉀快速法，按國標ZBX66040-87進行測定。

1.2.3 固定化酵母細胞的制備及醬油培養基的制備1.2.3.1 固定化酵母細胞的制備 酵母細胞培養基：葡萄糖100.0g；酵母膏7.0g；（NH4）2SO45.0g；NaH2PO41.0g；MgSO4·7H2O 0.5g；H2O 1000mL。

酵母細胞→活化→振蕩、分離（28℃，20r/min，24h）→5× 107CFU/mL對數增長期的酵母細胞→離心（8000r/min，10min）→磷酸緩沖溶液（0.1mol/L，pH7）→5mg/mL菌懸液→備用（4℃）[9-10]。

磁性殼聚糖微球→磷酸緩沖溶液（0.1mol/L，pH7，30mL）→溶脹12h→加入菌懸液→洗滌→濕態固定化細胞→備用（4℃）。

1.2.3.2 醬油培養基的制備 取麥芽糖17mL，生醬油40mL，定容至100mL，滅菌。

1.2.4 溫度對固定化酵母細胞發酵性的影響 將在最優條件下固定化好的酵母細胞50mg，分別加入到pH為6.5、食鹽含量為8%的100mL的醬油培養基中，分別置于20、24、28、32、36、40℃的培養箱中進行培養36h，發酵完成后將磁性殼聚糖微球與發酵液在磁場下分離，然后測定發酵液中還原糖的含量。比較不同溫度對固定化細胞發酵特性的影響。

1.2.5 鹽度對固定化酵母細胞發酵性的影響 將在最優條件下固定化好的酵母細胞50mg，分別加入到pH為6.5、食鹽含量為8%、10%、12%、14%、16%的100mL醬油培養基中，在30℃下培養36h，發酵完成后將固定化細胞與發酵液在磁場下分離，測定發酵液中還原糖含量。比較不同的食鹽含量對固定化細胞的影響。

1.2.6 pH對固定化酵母細胞發酵性的影響 將固定化酵母細胞分別加入到pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的100mL醬油培養基中，在鹽度為8%，30℃下培養36h。同樣發酵完成后測定發酵液中還原糖含量，比較不同pH對固定化細胞的影響。

1.2.7 響應曲面法優化固定化酵母細胞發酵條件采用Box-Behnken模型，以pH、溫度和食鹽含量為影響固定化酵母細胞發酵條件的考察因子（自變量），分別以X1、X2、X3表示，并以+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平，按方程X1=Xi-X0/X對自變量進行編碼[11]。其中Xi為自變量的編碼值，xi為自變量的真實值，X0為實驗中心點處自變量的真實值，X為自變量的變化步長[12]，因子編碼及水平見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3 數據處理

利用Design Expert7.1.1軟件進行分析，并采用多元回歸分析，擬合二次多項式回歸模型的Box-Behnken設計實驗，進行結果分析。

1.4 固定化酵母細胞發酵醬油增香成分HEMF的檢測

在最優的發酵條件下，將50mg固定化細胞加入到200mL的生醬油中，28℃，發酵72h，將固定化酵母細胞在磁場條件下與發酵液分離，對發酵液進行檢測。

2 結果與分析

2.1 溫度對固定化酵母細胞發酵性的影響

圖1 溫度對固定化酵母細胞發酵性的影響Fig.1 Influence of temperature on fermentation characteristics of immobilized yeast cells

溫度對酵母細胞發酵特性影響較大。由圖1可知，當溫度介于20～28℃區間時，醬油培養基中還原糖的含量呈下降趨勢，當溫度達到28℃時，還原糖的消耗量達到最低，之后隨著溫度的升高，還原糖的消耗量呈上升趨勢。溫度對微生物細胞生長、產物合成及代謝的影響是多方面的，不僅可以改變培養基的性質，而且會影響細胞代謝過程中各種關鍵酶的活性。因此，選擇28℃為最適溫度。

2.2 鹽度對固定化酵母細胞發酵性的影響

圖2 鹽濃度對固定化酵母細胞發酵性的影響Fig.2 Influence of salt concentration on fermentation characteristics of immobilized yeast cells

由圖2可知含鹽量越低，酵母細胞利用糖越充分，低滲透壓有利于酵母細胞的生長，隨著鹽分的增加，外界的滲透壓增高，酵母菌的增殖受到了影響，使其生長代速較慢，還原糖的消耗率降低，但食鹽含量在8%與10%時還原糖的含量相差不多，從中也可說明固定化的莫格球擬酵母細胞具有一定的耐鹽性。

2.3 pH對固定化酵母細胞發酵性的影響

圖3 pH對固定化酵母細胞發酵性的影響Fig.3 Influence of pH on fermentation characteristics of immobilized yeast cells

由圖3可知，pH在6～7之間還原糖的消耗量最多，pH在5～6之間其次，但還原糖消耗量的差別不大，pH=7.5時還原糖的消耗量達到最低，說明pH過高不利于固定化酵母細胞的增殖，影響固定化酵母細胞的正常活性。莫格球擬酵母細胞的最適生長pH在6左右，從圖中看出固定化酵母細胞的最適生長pH為6.5左右，略有增加。pH小于6時還原糖的消耗量略有降低，可能是由于固定化酵母細胞在發酵的過程中酵母利用糖類物質，產生了有機酸，使得在發酵過程中，發酵液越來越酸，從而影響了酵母細胞的增殖。

2.4 響應曲面法優化固定化酵母細胞發酵條件

2.4.1 固定化酵母細胞發酵條件的結果方差分析 采用Design Expert 7.0分析軟件對實驗結果進行二次多元回歸擬合，對表3數據進行方差分析后得到模型的二次多項回歸方程為：

Y=3.91-2.5×10-3X1+0.29X2+0.14X3-0.030X1X2-0.065X1X30.09X2X3+8.5×10-3X12-0.15X22+0.049X32；

從方程的方差分析表3可見，實驗所選用的模型極顯著（p＜0.01），模型的校正決定系數R2Adj=0.9671，說明該模型能解釋96.71%響應值的變化，僅有總變異大約3.29%不能用此模型來解釋；相關系數R= 0.9834，說明該模型擬合程度良好，實驗誤差小，該模型是合適的，可以用此來分析固定化酵母細胞的發酵條件。從表3回歸方程系數顯著性檢驗可知，模型一次項X2、X3極顯著；交互項X2X3顯著；二次項X22極顯著。說明各因子之間不是簡單的線性關系。各因子響應面交互圖見圖4～圖6。

圖4可知，在pH為最佳值6.5時，食鹽的含量與溫度對固定化細胞發酵條件的交互影響效應。從其響應曲面圖可以直觀地看出兩因素的交互作用較為顯著。當溫度與食鹽含量呈逐漸遞減的趨勢，發酵液中還原糖的含量逐漸降低，固定化細胞的發酵力就越佳。綜合分析，在實驗水平范圍內，食鹽的含量與溫度分別在8%和28～29℃范圍內時，還原糖含量消耗達到實驗中的最小值。

圖4 食鹽含量、溫度及其交互作用對固定化細胞發酵性的響應曲面Fig.4 Influence of salt concentration，temperature and their interactions on the response surface of fermentation characteristics of immobilized yeast cells

圖5 溫度、pH及其交互作用對固定化酵母細胞發酵性的影響的響應曲面Fig.5 Influence of temperature，pH and their interactions on the response surface of fermentation characteristics of immobilized yeast cells

表3 響應面模型方差分析表Table 3 Response surface model analysis of variance table

圖6 食鹽含量、pH及其交互作用對固定化酵母細胞發酵性的影響的響應曲面Fig.6 Influence of temperature,pH and their interactions on the response surface of fermentation characteristics of immobilized yeast cells

由圖5可知，在醬油發酵液食鹽含量為8%時，溫度與pH對固定化酵母細胞發酵性的交互影響效應。從其響應曲面圖可以直觀地看出，二者之間的交互作用不顯著。在實驗水平范圍內，發酵液中pH對固定化細胞的發酵性影響不大。溫度在28～29℃之間時，固定化酵母細胞在發酵液中所消耗的還原糖最多，隨著溫度的升高發酵液中所剩的還原糖含量逐漸升高。

由圖6可知，在發酵溫度為30℃時，發酵液中食鹽含量與pH對固定化酵母細胞發酵性的交互效應。由圖中可以看出兩者之間交互作用不顯著。但食鹽的含量對固定化酵母細胞的發酵性有一定的影響，當發酵液中pH一定時，隨著含鹽量的增加，還原糖的消化逐漸降低。pH則對固定化細胞的發酵性影響不大，當含鹽量一定時，在因素水平范圍內，還原糖消耗量基本不變。

通過回歸方程求解，固定化酵母細胞最佳條件：pH為6.57，溫度為28.46℃，食鹽含量為8%，此時理論還原糖含量為3.29g/mL。

2.5 驗證實驗結果分析

采用響應曲面法優化后的工藝條件，根據實際操作情況，將固定化酵母細胞最佳條件校正為pH6.57，溫度為28.5℃，食鹽含量為8%，經驗證實驗表明，還原糖含量可達3.27g/mL。

表4 驗證實驗Table 4 The results of Verify

2.6 醬油增香成分HEMF的檢測結果分析

圖7為固定化酵母細胞的醬油揮發成氣相色譜圖，圖中保留時間在9.403min時出現峰，說明在樣品中含有HEMF。圖8為未添加固定化酵母細胞的醬油揮發成氣相色譜圖，在HEMF標準品保留時間附近未出現峰，說明此樣品中不含有HEMF。說明添加固定化的莫格球擬酵母細胞可以有效的增加醬油的香氣。

圖7 添加固定化酵母細胞的醬油揮發成氣相色譜圖Fig.7 GC of soy sauce evaporate by adding immobilized yeast cells

圖8 未添加固定化酵母細胞的醬油揮發成氣相色譜圖Fig.8 GC of soy sauce evaporate by not adding immobilized yeast cells

3 結論

將固定化細胞應用于醬油的釀造過程中，最佳條件為溫度為28.5℃，食鹽含量為8%，pH為6.57，還原糖含量為3.27g/mL。通過氣相色譜分析，固定化酵母細胞所發酵的醬油有HEMF生成，氨基酸態氮含量也高于未添加固定化酵母細胞的醬油，說明添加固定化酵母細胞可以有效的增加醬油的香氣，提高醬油的品質。

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Study on fermentation characteristics of immobilized yeast cells in soy sauce

WANG Xin，HAN Chun-ran，LIU Xiao-fei，MA Yong-qiang*，GONG An-xu
（Key Laboratory of Food Science and Engineering，School of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

This paper firstly reported the fermentation characteristics of immobilized yeast cells in soy sauce.The magnetic chitosan microspheres as a carrier of immobilized yeast cells.The consumption of reducing sugar was elected as the indexes in the same time，single factor experiment and response surface methodology of temperature，salt content and pH had been taken out to evaluate the impact of various levels.The result of response surface methodology showed that the best temperature，salt content and pH were 28.5℃，8%，and 6.57，respectively.Calculationshowedthattheconsumptionofreducingsugarwas3.27g/mL.The immobilized yeast cells could increase the aroma effectively and improve the quality of soy sauce at the best fermentation conditions.

immobilization；fermentation；soy sauce

TS201.2

A

1002-0306（2014）12-0192-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.033

2013－08－27 *通訊聯系人

王鑫（1984-），女，在讀博士，講師，研究方向：食品化學，食品營養與安全。

哈爾濱市科技攻關計劃項目（2009AA6BN075）。