獼猴桃可溶性膳食纖維酶法制備工藝及抗氧化活性研究

韓 林，楊 琴，周 濃，郭冬琴，陳 林（.重慶三峽學院生命科學與工程學院，重慶40400；.江西農業工程職業學院機電工程系，江西樟樹3300）

獼猴桃可溶性膳食纖維酶法制備工藝及抗氧化活性研究

韓 林1，楊 琴2，周 濃1，郭冬琴1，陳 林1
（1.重慶三峽學院生命科學與工程學院，重慶404100；2.江西農業工程職業學院機電工程系，江西樟樹331200）

以獼猴桃皮渣為原料，采用酶法制備獼猴桃可溶性膳食纖維。在單因素實驗的基礎上，以纖維素酶添加量、酶解時間、酶解溫度和液料比為實驗因素，以可溶性膳食纖維提取率為響應值，采用四因素五水平的響應面分析法進行實驗，優化提取工藝參數。同時，考察了獼猴桃可溶性膳食纖維對DPPH和ABTS+自由基的清除效果及其還原能力。結果表明，酶法制備獼猴桃可溶性膳食纖維的最佳工藝條件為：酶添加量0.86%、酶解時間2.5h、酶解溫度62℃和液料比27∶1（mL/g），在該條件下獼猴桃可溶性膳食纖維提取率預測值為13.379%，驗證值為12.983%，響應面法對獼猴桃可溶性膳食纖維提取條件的優化是可行的，可用于實際預測。抗氧化活性實驗表明獼猴桃可溶性膳食纖維具有較強的自由基清除效果和還原能力，對DPPH和ABTS+自由基的EC50分別為4.68mg/mL和1.28mg/mL。

獼猴桃，可溶性膳食纖維，響應面分析，抗氧化活性

獼猴桃是獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬植物的一種漿果，又稱獼猴梨、藤梨、羊桃、毛木果等，原產于湖北宜昌，被譽為“水果之王”、“世界珍果”，含有豐富的維生素、氨基酸和鉀、鈣、鎂、磷等礦物元素，以及膳食纖維、有機酸等，尤其是維生素C的含量，比柑橘高5～10倍，比蘋果高20～80倍[1-2]。此外，還含有多種生物活性物質，如三萜和黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、延緩衰老、降血脂等功效[3-5]。

膳食纖維被認為是繼蛋白質、脂類、糖、維生素、礦物質等六大營養素之外的“第七營養素”[6]。研究表明，許多疾病如高血壓、高血脂、糖尿病等都與膳食纖維的攝入量不足有關，而根據美國食品藥物管理局（FDA）頒布的優良和優秀營養含量的定義，獼猴桃的膳食纖維含量達到優秀標準[7]。目前，獼猴桃可溶性膳食纖維的提取方法常用酸水解法和酶水解法[8-9]。本實驗以獼猴桃皮和渣為原料，采用纖維素酶解制備可溶性膳食纖維，并利用響應面法優化了制備工藝條件，同時考察了獼猴桃可溶性膳食纖維的抗氧化活性，為提高原料的利用率和附加值，以及深加工提取理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

獼猴桃（綠肉） 新西蘭產，購于重慶萬州區沃爾瑪超市；纖維素酶 上海華藍化學科技有限公司；無水乙醇 分析純，四川西隴化工有限公司。

ZXFD-A5250型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海智成分析儀器制造有限公司；FW80型高速萬能試樣粉碎機 上海勝啟儀器儀表有限公司；800型離心機 上海手術器械廠；HH-4型號數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；SHZ-95B型循壞水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；AL104型電子天平 梅特勒一托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗工藝流程 獼猴桃打漿，去汁，留渣→恒溫干燥→粉碎過40目篩→稱取5g獼猴桃渣，加纖維素酶→水浴酶解，抽濾→濾液加4倍體積乙醇沉淀1h后再次過濾，干燥，得到可溶性膳食纖維（SDF）。

操作要點：

a.獼猴桃榨汁后，取獼猴桃渣在55℃烘箱中烘至恒重，粉碎后過40目篩備用。

b.稱5g獼猴桃渣，加一定量纖維素酶和蒸餾水，調節pH至5.5，置于水浴鍋中進行酶解。

c.酶解完成后進行過濾，所得的濾液加入4倍的乙醇，靜置1h，在4000r/min的離心機中離心15min，再過濾，沉淀干燥得到獼猴桃可溶性膳食纖維（SDF）。1.2.2 獼猴桃渣膳食纖維提取率計算 SDF提取率（%）=（獼猴桃可溶性渣膳食纖維質量/獼猴桃渣質量）×100。

1.2.3 單因素實驗 分別選取酶添加量（0.4%、0.6%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%），酶解時間2.0h，酶解溫度55℃，液料比25∶1mL/g；酶解時間（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0h），酶添加量0.6%，酶解溫度55℃，液料比25∶1mL/g；酶解溫度（45、50、55、60℃、65、70℃），酶添加量0.6%，酶解時間2.0h，液料比25∶1mL/g；液料比（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1mL/g），酶添加量0.6%，酶解時間2.0h，酶解溫度55℃4個條件，進行獼猴桃可溶性膳食纖維提取的單因素實驗，考察各因素對SDF提取率的影響。

1.2.4 獼猴桃SDF提取工藝的響應面法優化[10]在單因素實驗的基礎上，分別以酶添加量、酶解時間、酶解溫度和液料比4個因素為響應變量，以獼猴桃SDF提取率為響應值，采用響應分析進行提取條件的優化[10]。各因素的水平編碼如表1所示。

表1 響應面因素水平編碼表Table 1 Variables and levels in response surface method

1.2.5 抗氧化活性研究

1.2.5.1 獼猴桃SDF對DPPH自由基的清除作用[11]準確移取3.9mL質量濃度為25.61mg/L的DPPH溶液，加入0.1mL體積分數為70%的乙醇溶液，混勻，在波長517nm處測吸光度Ac。將各樣品提取物配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL的不同質量濃度，分別準確移取0.1mL不同濃度的各樣品溶液，加入3.9mL DPPH溶液（質量濃度為25.61mg/L），混合均勻，室溫避光反應30min后于波長517nm處測定吸光度Ai。同時測定3.9mL體積分數為70%的乙醇溶液中加入0.1mL不同濃度各樣品溶液的吸光度Aj[11]。DPPH·清除率為：

1.2.5.2 獼猴桃SDF對ABTS+自由基的清除作用[12-13]取5.0mL 7mmol/L的ABTS+溶液，加入88.0μL 140mmol/L的過硫酸鉀，在室溫下置于暗處反應12～16h，形成ABTS+自由基儲備液。在734nm處，用體積分數70%的乙醇稀釋ABTS自由基儲備液，備用。準確量取0.1mL不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL）的樣品溶液，加入3.9mL ABTS+溶液，混勻，在室溫下反應6min，于734nm處測定吸光度AE。同時吸取3.9mL ABTS+溶液，加入0.1mL體積分數70%的乙醇溶液于734nm處測定吸光度AB[12-13]。ABTS自由基清除率按下式計算：

ABTS+自由基清除率（%）=100×（AB－AE）/AB×100

1.2.5.3 獼猴桃SDF的還原力[14]在2.5mL pH6.6的磷酸鹽緩沖液中依次加入不同質量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/mL）的各樣品溶液2.5mL，質量分數1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混合均勻后在50℃恒溫20min，冷卻，再加入2.5mL質量分數10%的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min離心分離10min，取上層清液5mL，加蒸餾水5mL和質量分數0.1%FeCl3溶液1.0mL，在波長700nm處測定吸光度，同時進行空白實驗[14]。

1.3 統計學分析

使用SAS 9.0軟件對數據進行統計分析，每組實驗均重復三次。

圖1 酶添加量對獼猴桃SDF提取率的影響Fig.1 Effect of the amount of cellulose on the extraction ratio of SDF

2 結果與分析

2.1 酶添加量對獼猴桃SDF提取率的影響

由圖1可知，隨著酶添加量的增加，獼猴桃SDF提取率逐步上升，當酶添加量達到0.6%時，SDF的提取率為7.49%，達到最大值，隨著酶添加量的繼續提高，SDF提取率則開始降低。說明酶的添加量與SDF的提取率并不是呈正相關，而是存在著一個臨界點，只有酶添加量適當時，才能提取得到最大的SDF，這與何余堂等[15]的研究結果相似。選擇0.6%為最佳酶添加量。

2.2 酶解時間對獼猴桃SDF提取率的影響

酶解時間對獼猴桃SDF提取率的影響如圖2所示，當酶解時間達到2h時，SDF提取率達到最大值，為8.08%，繼續增加酶解時間，SDF提取率逐步下降。因為可溶性膳食纖維主要成分為果膠，酶解時間過長，會增加果膠被解酯裂解的量，并且果膠在水溶液中部分會被氫離子水解而降低果膠產量，從而影響SDF的提取率[16]。選擇2h為最佳酶解時間。

圖2 酶解時間對獼猴桃SDF提取率的影響Fig.2 Effect of extract time on the extraction ratio of SDF

2.3 酶解溫度對獼猴桃SDF提取率的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，SDF的提取率快速升高；在酶解溫度為55℃時，SDF得率最大，超過60℃后，SDF得率顯著下降。這是由于每種酶都有其最適反應溫度，溫度過高或過低都將影響酶的活性，另外溫度過高會使可溶性膳食纖維本身的分子結構受到破壞，從而使提取率降低[8]。因此，選擇55℃為該酶的最適反應溫度。選擇55℃為最佳酶解溫度。

圖3 酶解溫度對獼猴桃SDF提取率的影響Fig.3 Effect of extract temperature on the extraction ratio of SDF

2.4 液料比對獼猴桃SDF提取率的影響

圖4表明，隨著液料比的增加，獼猴桃渣SDF提取率快速升高。當液料比為25∶1mL/g時，SDF的提取率達到5.71%，如果液料比繼續增加，SDF提取率則開始明顯下降。因此選擇20∶1～30∶1mL/g作為SDF提取的液料比。

圖4 液料比對獼猴桃SDF提取率的影響Fig.4 Effect of the liquid-to-solid ratio on the extraction ratio of SDF

2.5 獼猴桃SDF提取工藝的響應面法優化

根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理，在單因素實驗的基礎上，選取酶添加量（X1）、酶解時間（X2）、酶解溫度（X3）、液料（X4）4個因素，采用四因素五水平的響應面分析方法對獼猴桃SDF提取率的工藝條件進行優化。

表2 獼猴桃SDF提取響應面實驗設計及結果Table 2 Experimental design and result of central composite test on the extraction of percentage from Kiwifruit

響應面設計方案與結果如表2所示。利用SAS 9.0軟件對表2實驗數據進行分析，得到獼猴桃SDF提取率對酶添加量（X1）、酶解時間（X2）、酶解溫度（X3）和液料比（X4）的二次多項回歸模型為：Y＝9.526+2.010X1+ 2.145X2+2.405X3+1.472X4-3.552X12+2.086X1X2-4.697X22+4.344X1X3-0.038X2X3-2.927X32+0.628X1X4+ 0.931X2X4+0.042X3X4-4.592X42。

回歸模型的方差分析（表3）表明，此響應面回歸模型達到顯著水平（p＝0.0325＜0.05），其復相關系數R2為0.9823，說明此模型與實驗實際擬合較好，實驗失擬較小，能夠真實的反應實驗結果[17]。表4的分析結果表明，在所選的各因素水平范圍內，對獼猴桃SDF提取率影響的大小順序為：酶解溫度、液料比、酶解時間、酶添加量。由顯著性檢驗可知，X22、X42對獼猴桃SDF提取率的影響極顯著（p＜0.01），X1、X2、X3、X4、X12、X1X3、X32的影響顯著，而X1X2、X2X3、X1X4、X2X4、X3X4的影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression model

表4 二次多項式回歸模型系數的顯著性檢驗Table 4 Regression coefficients of predicted quadratic polynomial model

根據回歸方程，做出響應曲面圖（如圖5所示），可直觀的反映出各因素對響應值的影響。由圖5可知，各因素之間的交互作用對獼猴桃SDF提取率均有一定的影響，但其中以X1和X3之間的交互影響顯著，表現為曲面比較陡，而其他因素間的交互影響并不顯著。

圖5 因素交互作用對獼猴桃SDF提取率影響的響應曲面Fig.5 Response surface for effects of interaction of various factors on response value on the extraction ratio of SDF from kiwifruit

由SAS分析得到響應值Y的最大估計值為13.379%，此時酶添加量X1、酶解時間X2、酶解溫度X3和液料比X4對應的編碼值分別為：1.312452、0.547091、1.390249和0.312585，實際值為：酶添加量0.862%、酶解時間2.547h、酶解溫度61.951℃和液料比26.563∶1mL/g。為了實際操作方便，選擇酶添加量0.86%、酶解時間2.5h、酶解溫度62℃和液料比27∶1mL/g對獼猴桃SDF提取進行驗證實驗。3次平行實驗得到的實際獼猴桃SDF提取率為12.983%，與預測值非常接近，相對誤差為2.95%。因此，利用響應面法優化龍獼猴桃SDF提取條件是可行的，具有實際應用價值。

2.6 獼猴桃SDF抗氧化活性

獼猴桃SDF的抗氧化活性實驗結果如表5所示。從表5可以看出，獼猴桃SDF對DPPH自由基和ABTS+自由基均有一定的清除能力，并且隨質量濃度的增加而增強，呈一定的線性關系，R2分別為0.9578和0.9335，其EC50分別為4.68mg/mL和1.28mg/mL。

研究表明，抗氧化活性與還原力之間普遍存在相關性，還原力大小可反映出物質的抗氧化活性強弱[18]。還原力實驗中，吸光度越高，表示還原能力越強。由表5可知，獼猴桃SDF具有一定的還原能力，與自由基清除率相似，隨著SDF質量濃度的增加而增強，也呈一定的線性關系，R2為0.9919。

表5 獼猴桃SDF抗氧化活性實驗結果Table 5 Result of antioxidant activity of SDF from Kiwifruit

3 結論

根據Box-Benhnken的中心組合實驗設計原理，在單因素實驗的基礎上，采用四因素五水平的響應面分析方法，對獼猴桃SDF纖維素酶解提取工藝進行了優化，確定最佳工藝條件為：酶添加量0.86%、酶解時間2.5h、酶解溫度62℃和液料比27∶1mL/g，在此條件下測得實際提取率為12.983%，與預測值的相對誤差為2.95%。同時得到了獼猴桃SDF提取率與各因素變量的二次多項式回歸方程，該模型回歸極顯著，對實驗擬合較好，具有實際應用價值。抗氧化活性實驗表明，獼猴桃SDF具有較強的自由基清除效果和還原能力。

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Study on preparation of soluble dietary fiber by enzymatic method from kiwifruit and its antioxidant activity

HAN Lin1，YANG Qin2，ZHOU Nong1，GUO Dong-qin1，CHEN Lin1
（1.College of Life Science and Engineering of Chongqing Three Gorges University，Chongqing 404100，China；2.Department of Electrical Engineering of Jiangxi Agricultral Engineering College，Zhangshu 331200，China）

The enzymatic method was adopted to extract soluble dietary fiber from the skin residue of kiwifruit. On the basis of one factor test，the method of response surface analysis with 4 factors including the amount of cellulose，extract time，extract temperature and liquid-to-solid ratio on the extraction ratio of soluble dietary fiber was adopted.Meanwhile，the antioxidant activity of the soluble dietary fiber was tested.The result showed that，these optimal extraction conditions were as follows：the amount of cellulose 0.86%，extract time 2.5h，extract temperature 62℃and the liquid-to-solid ratio 27∶1mL/g，the predicted value and measured value of the soluble dietary fiber were 13.379%and 12.983%，respectively.Results indicated that the obtained mode developed by response surface methodology was feasible for practical prediction.The antioxidant activity test showed that，the soluble dietary fiber from kiwifruit had strong radical scavenging activity and reducing capacity，the EC50of DPPH and ABTS were 4.68mg/mL and 1.28mg/mL，respectively.

kiwifruit；soluble dietary fiber（SDF）；response surface analysis；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0197-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.034

2013－07－04

韓林（1985-），男，碩士研究生，研究方向：果蔬深加工與綜合利用。

重慶市教委科學技術研究項目（KJ131114）；重慶三峽學院青年項目（12QN12）。