茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉氨酶在酸奶中的應用研究

張莉麗，韓 雪，張蘭威，夏東海，馬崇玉，馮 鎮（.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱50030；.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱50090）

茂原鏈霉菌谷氨酰胺轉氨酶在酸奶中的應用研究

張莉麗1，韓 雪2，*，張蘭威2，夏東海1，馬崇玉1，馮 鎮1
（1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150090）

為了研究本實驗室制備的谷氨酰胺轉氨酶（TGase）的應用特性，采用兩種不同的TGase添加工藝生產酸奶：第一種采用TGase交聯乳后加熱鈍化酶活力，然后添加發酵劑制備酸奶；第二種采用活性TGase與發酵劑同時添加到乳中的方法生產酸奶。通過對比這兩種酸奶和對照樣品（未添加TGase）的發酵時間、質構變化、乳清析出量和感官評價，確定此酶在酸奶中的添加條件。結果發現活性TGase交聯酸奶的堅實度、粘度、乳清析出量和感官評價都有很大的改善，并且確定此TGase最適添加量為30U/L。

谷氨酰胺轉氨酶，酸奶，質構特性，感官評價

谷氨酰胺轉氨酶（Transglutaminase，EC2.3.2.13，R-glutaminyl-peptide：amnieγ-glutamyl-transferase，簡稱TGase）又名轉谷氨酰胺酶，它通過誘導肽段之間ε（γ-谷氨酰）賴氨酸鍵作用，催化蛋白質分子內和分子間發生交聯，蛋白質和氨基酸之間連接，以及蛋白質分子內谷氨酰胺基的水解，從而改善蛋白質的功能特性和結構，并能通過引入賴氨酸提高蛋白質的營養價值，生產出滿足人們需求的高營養食品[1]，因此被譽為“21世紀超級黏合劑”。

酸奶具有良好的益生功能，贏得了廣大消費者的青睞，但生產廠家為了提高其穩定性已經采取了一些方法改善其質地，如增加非脂固形物或/和蛋白質含量，或者添加一些凝膠物質。但是一些國家不允許添加穩定劑或可能產生毒性成分的添加劑，因此TGase已經被用來改善酸奶的凝膠特性和質地[2-4]。本課題組利用MgCl2脅迫提高了茂原鏈霉菌發酵生產TGase的產量[5]，并且通過分離純化，得到了電泳純的TGase，通過研究它的酶學性質發現，它比現有報道的鏈霉菌TGase具有更好的熱穩定性和pH穩定性[6]。為了進一步研究此酶的應用特性，本文對比兩種TGase添加工藝，即分別采用交聯后鈍化酶活力再發酵和與發酵劑同時添加活性TGase兩種工藝生產酸奶，通過研究兩種酸奶和對照樣品（未添加TGase）的發酵時間、堅實度、粘度、乳清析出量和感官評價，確定此酶在酸奶中的添加條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷氨酰胺轉氨酶 實驗室自制；牛奶 哈爾濱市香坊農場；白砂糖 上海農豐實業有限公司一分公司；保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌 本實驗室保存。

PB-10型酸度計 北京賽多利斯儀器系統有限公司；TAX-XT2i型質構分析儀（TPA） 英國Stable Micro Systems公司；DHP-927型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；LDZX-40IC型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；3-30K型冷凍離心機 Sigma公司；高壓均質機。

1.2 實驗方法

1.2.1 凝固型酸奶的生產 工藝流程如下所示：

乳酸菌純培養物→母發酵劑→生產發酵劑

↓

原料奶預處理→標準化→配料→均質→殺菌→冷卻→加發酵劑→分裝→保溫發酵→冷卻→后熟→凝固型酸奶。

1.2.2 酸奶的制備 工藝操作如下所示：

a.對照樣品：發酵過程不加TGase，只接種發酵劑。

b.活性TGase交聯酸奶：在添加發酵劑的同時，分別按照20、30、40、50、60U/L的濃度添加TGase，發酵后測量酸奶的各個指標。

c.TGase鈍化酸奶：乳經殺菌冷卻后分別按照20、30、40、50、60U/L的濃度添加TGase，在40℃反應2h，加熱到95℃，保持5min，使酶鈍化，加入發酵劑，發酵后測量酸奶的各個指標，與a、b的結果進行比較。

1.2.3 酸奶凝乳時間的確定 將對照樣品、活性TGase交聯酸奶和添加TGase后鈍化酸奶分別在43℃保溫發酵至pH4.5，記錄發酵時間。

1.2.4 酸奶質構（TPA）的測評方法 酸乳凝固后放入冰箱，4℃冷藏，冷藏24h后，采用質構分析儀測量酸乳的堅實度、稠度、粘度、粘附性指數。TPA測定參數如下：測定前探頭速度1.00mm/s；測定時探頭速度1.00mm/s；測定后探頭速度1.00mm/s；測定距離20mm；探頭柱型AEC，盤徑35mm；感應力Auto-5g；數據攫取速度200pps。

1.2.5 乳清析出量測定 乳清析出量即測定酸乳膠體脫水收縮作用的敏感性（Susceptibility to Syneresis，STS）：在6℃下將100mL酸乳小心傾入到一個120目不銹鋼網篩中，2h后收集瀝出的乳清，用100mL量筒量出體積[7]。計算公式如下：

1.2.6 感官評分 經過后熟的酸奶由5位食品專業研究生和6位普通消費者對產品的色澤、氣味、滋味和組織狀態進行評價，根據評分標準（見表1）評分，以100分制填寫評分表，90～100分（很好）、70～80分（較好）、50～60（一般）、30～40（較差）、10～20（很差）。

2 結果與分析

2.1 TGase不同添加方式對凝乳時間的影響

當酸奶pH下降到4.5時，酸奶完全凝固。對照樣品（TGase添加量為0U/L）和添加少量活性酶（20U/L和30U/L）酸奶樣品的凝乳時間在245～260min之間，添加高濃度活性酶的酸奶樣品凝乳時間延長（見圖1）。這與Lorenzen[8]、F?rgemand[9]和Ozer等[10]的研究結果一致。他們發現向酸奶中添加活性TGase會延長發酵時間。F?rgemand等[9]認為酸奶中蛋白質交聯影響了乳酸菌對低分子量肽的利用，抑制了乳酸菌生長，因此延長了發酵時間。但是本文的研究結果與B?nisch等[11]的發現不同，他們認為這種矛盾的結果是由于實驗條件不同造成的。添加TGase后鈍化酸奶的凝乳時間要遠遠超過對照樣，隨著酶添加量的增大，凝乳時間變化不明顯。圖1還表明，加酶后鈍化與添加活性酶酸奶相比，前者的凝乳時間要遠遠大于后者。

圖1 TGase不同添加方式對凝乳時間的影響Fig.1 Addition methods of TGase on the yogurt curding time

表1 感官評分標準Table 1 Sensitive evaluation

2.2 TGase不同添加方式對酸奶質構的影響

利用質構儀來測試酸奶的堅實度、稠度、粘度、粘附性指數。由表2可以看出，在活性TGase交聯酸奶中，酶添加量越大，酸奶凝膠強度越大，酸奶越稠厚，同時，細膩度也越差；當活性TGase添加量達40U/L時，測得其堅實度、稠度、粘度、粘附性指數幾乎為對照樣品（TGase添加量為0U/L）的二倍。這表明，添加TGase導致乳中的蛋白質發生交聯，從而增加產品的凝膠強度和粘度。Gauche等[12]認為質構改善是由于TGase交聯蛋白形成ε-（γ-glutamyl）lysine造成的。由表2還可以看出，在添加等量TGase時，TGase鈍化酸奶的堅實度、稠度、粘度、粘附性指數均低于活性TGase酸奶。當TGase添加量較小時，TGase鈍化酸奶的堅實度、稠度、粘度和粘附性指數與對照樣品差異不顯著。只有當TGase的添加量達到60U/L以上時，才能明顯提高酸奶的堅實度、稠度、粘度和粘附性指數。這與Sanli和Lorenzen等的研究結果一致，他們認為凝固型酸奶發酵過程中，活性TGase可以提高其凝膠強度[3，8]。

表2 兩種酸奶質構分析對比Table 2 The contrasting texture of two kinds of yoghurt

2.3 TGase不同添加方式對乳清析出量的影響

TGase不同添加方式對酸奶乳清析出量影響的結果見圖2。由圖2可以看出，乳清析出量隨著酶添加量增大而減小，這是由于TGase引發乳中的蛋白質發生永久交聯，導致凝膠滲透性降低，最終使酸奶具有更緊密、穩定的微觀結構，更多的自由水被鎖在酸奶凝膠的網絡中。當TGase添加量相同時，活性TGase交聯酸奶的乳清析出量明顯低于TGase鈍化酸奶，這可能是由于鈍化酸奶的蛋白質交聯程度低于活性TGase交聯酸奶造成的。

圖2 TGase不同添加方式對乳清析出量的影響Fig.2 Addition methods of TGase on the whey syneresis

2.4 TGase不同添加方式對感官評價的影響

由圖3可知，活性TGase交聯酸奶實驗中，TGase添加量較低（20U/L）的酸奶得分與對照組（TGase添加量為0U/L）差異不顯著；TGase添加量在30U/L的酸奶評分最高，因為其凝乳結實，表面比較光亮，質地也較細膩，酸奶的香味濃重；而添加量過大（50、60U/L）的酸奶由于結構較松散、切面較碎、呈沙粒狀，不容易被評委接受，因此得分較低。兩種酸奶的對比可知，TGase被鈍化酸奶的感官得分要低于活性TGase交聯酸奶，只有添加量在40U/L的兩個酸奶評分幾乎相同。由以上結果可以發現，活性TGase交聯酸奶中酶的最適添加量為30U/L，而TGase鈍化酸奶，其最適添加量為40U/L。

圖3 感官評價對比圖Fig.3 Sensitive evaluation

3 結論

目前有很多提高凝固型酸奶穩定性的方法，包括添加乳粉，通過超濾或添加乳蛋白來提高乳中的蛋白質含量、添加一些穩定劑來控制酸奶的質構缺陷，從而提高酸奶的濃度和質地。目前的研究表明，TGase交聯乳中蛋白是替代調節固形物或添加穩定劑的有效方法。本文通過向酸奶中添加TGase，并且采用交聯后鈍化和與發酵劑同時添加活性TGase兩種工藝生產酸奶，結果發現活性TGase交聯酸奶的堅實度、粘度、乳清析出量和感官評價有很大的改善，并且確定此TGase最適添加量為30U/L。另外，雖然添加TGase交聯后再鈍化的工藝也能改善酸奶的質構，但TGase的添加量較大；而且當TGase添加量過大時，感官評價分值很低。因此，TGase的添加方式為添加發酵劑的同時加入TGase，最適添加量為30U/L。

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Application of transglutaminase from Streptomyces mobaraense in yoghurt

ZHANG Li-li1，HAN Xue2，*，ZHANG Lan-wei2，XIA Dong-hai1，MA Chong-yu1，FENG Zhen1
（1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China）

In order to study the properties of transglutaminase prepared in the laboratory，two different addition techniques of TGase were compared.One was to add fermentation agent after crosslinking milk by TGase following inactivation TGase by heat treatment，the other was to add TGase and fermentation agent to milk at the same time.These adding conditions of TGase were determined by comparing the two kinds of yogurt and control samples（without TGase）.Fermentation time，texture changes，whey precipitation and sensory evaluation of yogurt were compared.Results showed that the firmness，viscosity，whey precipitation and sensory evaluation of the yogurt crosslinked by the active TGase were greatly improved，and the optimum adding amount of TGase was 30U/L.

transglutaminase；yogurt；textural properties；sensory evaluation

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0210-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.037

2013－12－18 *通訊聯系人

張莉麗（1981－），女，博士，講師，研究方向：蛋白質工程和發酵工程。

國家自然科學基金項目（31301545）。