西北漿水中兼性厭氧菌的分離與鑒定

李雪萍，李建宏，孟憲剛，謝佳佳（蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅蘭州730070）

西北漿水中兼性厭氧菌的分離與鑒定

李雪萍，李建宏，孟憲剛*，謝佳佳
（蘭州交通大學化學與生物工程學院，甘肅蘭州730070）

采用多點采樣法獲取西北不同地區的漿水為實驗材料，采用改良的焦性沒食子酸法和平板涂布法分離并純化其中的兼性厭氧微生物，共得到17株菌株，并對純化后的各菌株進行菌落形態觀察、革蘭氏染色、生化特性研究以及16S rDNA鑒定。結果發現，漿水中存在多種兼性厭氧菌株，其大多為乳桿菌屬（Lactobacillus）或雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等益生菌，但其中還存在部分雜菌和有害菌；另外還發現不同地區的漿水中兼性厭氧菌種類差別較大。

漿水，兼性厭氧菌，分離，鑒定

漿水是西北人民夏季飲食中極受歡迎的一種發酵蔬菜制品，它由多種益生菌協同發酵而成，不僅營養豐富，更有清熱解暑之功效[1]，常用來做漿水面等食品。近年來，漿水受到越來越多的科研工作者的關注，對其的研究也取得了一系列成果，如不同原料發酵漿水中微生物數量的變化及收獲日期的確定[2]、漿水中微生物的分離鑒定[1，3-4]、漿水發酵過程中硝化還原酶活性和亞硝酸鹽含量的變化關系的研究[5]等。其中，微生物的分離鑒定是一項非常重要的工作，是深入研究漿水發酵過程以及實現標準化生產的基礎。但是，綜觀前人的研究可以發現，在漿水微生物的分離鑒定方面，前人研究普遍存在以下方面的問題：一是所采用的都是單一采樣點的樣品，然而西北地區地域遼闊，民族眾多，不同地方人民生活習慣和飲食習慣差別巨大，漿水的腌制手法也千差萬別，因而，應用某一單一采樣點的樣品其代表性很有限；二是前人在微生物方面大多以好氧菌為主要研究對象，兼性厭氧菌的研究較少，但是在漿水發酵過程中具有益生保健作用的微生物大部分為兼性厭氧菌。

本課題組曾初步進行了一些兼性厭氧微生物方面的研究工作[3]，但采樣點單一，總體工作較為粗糙，大部分都只鑒定到屬。因此，細致地進行漿水兼性厭氧菌的研究，就成為一項極為迫切的工作。另一方面，雖然近些年來出現的高通量測序技術及片段多態性技術等分子生物學新技術在微生物多樣性分析方面展現出了極大的優勢，但是，傳統的純種分離鑒定技術能夠發現和提供優良的微生物菌種，為實際應用奠定基礎，因此，其仍是一項不可替代的重要工作。鑒于此，本研究以西北不同地區的漿水樣品為材料，進行兼性厭氧菌的分離與鑒定，旨在為漿水的進一步深入研究和標準化的開發利用打下基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

樣品分別從西北五個地區取樣，取樣時參考當地食用習慣，在漿水處于風味最佳的階段時取樣，取得樣品后，儲存于無菌容器，低溫運輸至實驗室，立即分離，采樣地點如表1所示；細菌基因組DNA提取試劑盒北京百泰克生物技術有限公司，離心柱型；2000bp DNA Ladder美國Biomiga公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、Tris-飽和酚美國Sigma公司；瓊脂糖生工BBI生物工程股份有限公司；β-巰基乙醇天津市精細化工研究所，分析純；異戊醇上海中秦化學試劑有限公司，分析純；PCR擴增試劑由上海生工提供。

表1　樣品來源Table 1　Source of samples

Centrifuge 5418R型臺式離心機德國艾本德公司；MyCycler型PCR儀美國伯樂生命醫學產品公司；HE-120型電泳儀、2500型凝膠成像儀上海天能科技有限公司；Nano Drop 2000型紫外分光光度計美國賽默飛世爾科技公司；各型加樣槍德國艾本德公司；Sorvall legend RT型離心機美國Kendro實驗室產品公司。

1.2實驗方法

1.2.1培養基的配制牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000mL；

MRS培養基：蛋白胨10.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、牛肉膏10.0g、葡萄糖20.0g、酵母膏5.0g、乙酸鈉5.0g、吐溫80 1mL、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、瓊脂18g、蒸餾水1000mL。

1.2.2兼性厭氧菌的分離用滅菌生理鹽水稀釋漿水，并在平板上涂布，采用改良的焦性沒食子酸法[6]保持厭氧環境，37℃下培養48h觀察，稀釋度以平板表面出現單菌落為度。挑選單菌落，再次用劃線法分離純化并鏡檢。挑選菌落形態統一、菌體顯微形態一致的菌株進行后續實驗。

1.2.3菌落形態觀察將已純化的菌株活化后，接種在相應的培養基上進行培養，培養至24～48h時觀察并記錄菌落形狀、色澤、隆起、表面平整度、邊緣形狀等。

1.2.4革蘭氏染色將活化后的菌體培養至24～ 36h，取樣涂片，用三步法做革蘭氏染色，并在油鏡下觀察菌體形狀和顏色，分別用Staphyloccocus aureus和Escherichia coli做陽性和陰性對照。

1.2.5生化特性研究將已純化的各兼性厭氧菌株活化后分別進行如下實驗[7-8]：接觸酶反應實驗、淀粉水解實驗、明膠液化實驗、石蕊牛奶實驗、糖發酵實驗、硫化氫產生實驗、吲哚產生實驗、乙酰甲基甲醇（V-P）實驗，準確觀察并記錄實驗結果。根據菌落形態、革蘭氏染色結果及生化特性研究結果，參照《伯杰細菌鑒定手冊》[9]、《常見細菌系統鑒定手冊》[10]查詢各兼性厭氧細菌的分類地位。

1.2.6分子生物學鑒定

1.2.6.1DNA的提取用細菌基因組DNA提取試劑盒提取。

1.2.6.2DNA純度及濃度分析用瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度法檢測。

1.2.6.3引物設計與合成擴增引物為細菌16S rDNA擴增通用引物27F-1492R，由北京華大基因研究中心合成。序列分別為：

27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3

1.2.7擴增反應擴增反應在梯度PCR儀上進行PCR反應，體系如表2所示。

表2　PCR擴增反應體系Table 2　PCR amplification reaction system

反應程序為：94℃預變性5min，進入循環，94℃變性45s，54℃退火45s，72℃延伸90s，35個循環，最后72℃延伸10min。

1.2.8擴增產物的檢測與測序反應產物檢測通過瓊脂糖凝膠電泳法完成，DNA Marker為2000bp DNA Ladder，擴增產物的測序交由北京華大基因研究中心完成。

1.2.9序列分析使用軟件DNAMAN4.0進行序列分析；利用CLUSTALX（1.8）對序列分別進行比對；在CLUSTAL中實現“掐頭去尾”；在BLAST獲得相似序列。

2.1西北漿水中兼性厭氧菌的分離結果

從西北不同的地區分離出共17株菌，其中寧夏3株，分別是：MNY-1、MNY-2、MNY-7；慶陽3株，分別是：MQY-2、MQY-7、NQY-8；甘南4株，分別是：MGY-4、MGY-5、MGY-7、NGY-2；天水2株，分別是：MTY-2、NTY-4；蘭州5株，分別是：MLY-1、MLY-4、MLY-9、MLY-1、MLY-15。

2.2各菌株菌落形態觀察及革蘭氏染色

將實驗獲得的17株菌在MRS培養基上培養24～ 48h觀察，可以發現實驗菌株菌落形態呈現典型的細

2　結果與分析

菌菌落形態的特征，均為圓形、白色或米白色，表面光滑。顯微觀察發現大多為桿菌，僅MLY-9和NTY-4為鏈球菌，且多數為革蘭氏陽性菌。

2.3生化特性研究

實驗結果如表3所示。

生理生化鑒定是基于各種微生物在代謝類型上的差異性。不同微生物具有不同的酶系統，因而其物質代謝的能力就不同，發酵類型和產物也千差萬別。即使在分子生物學技術和手段不斷發展的今天，細菌的生理生化反應在菌株的分類鑒定中仍有很大不可替代的作用[10]，是分子生物學手段的重要補充。本研究中，選取了接觸酶反應，淀粉水解反應等10項指標進行鑒定，其結果和《伯杰細菌鑒定手冊》以及《常見細菌系統鑒定手冊》中的描述符合性良好，將相應鑒定結果和分子生物學鑒定結果對比（見表4），吻合良好，二者相互印證，說明了本研究鑒定準確。

2.4基因組DNA濃度和純度檢驗

圖1　供試菌株基因組DNA電泳圖Fig.1　Genomic DNA electrophoretogram of Bacterial strain for test

所提取的基因組DNA經0.8%的瓊脂糖電泳、UVP凝膠成像系統下觀察可以清晰地看到基因組DNA大小約為23kb，且加樣口無亮光，帶型完整，無拖尾現象。通過過紫外分光光度計測定OD260、OD280并計算出OD260/OD280的值在1.8～2.0，計算得DNA濃度為在40～ 80ng/L，并結合電泳圖譜得出所提DNA純度較高，RNA和蛋白質含量較少，無降解。綜上，表明所提DNA完整性好，純度高，符合后續研究要求。

2.516S rDNA擴增產物電泳檢測

通過選用原核生物通用引物進行PCR擴增反應，擴增出了菌株的16SrDNA區序列，目的片段在1000～ 2000bp之間，與預期在1400bp左右相一致，條帶清晰明亮，沒有出現彌散帶和其他雜帶，完整性較好（圖2）。

圖2　供試菌株16S rDNA區擴增產物電泳圖Fig.2　Amplification products electrophoretogram for 16S rDNA district of Bacterial strain for test

表3　生化特性實驗結果Table 3　Experimental result of the biochemical characteristic

2.6各菌株種屬的確定

綜合形態鑒定、生化實驗結果和分子鑒定結果，發現本研究中所分離的菌株形態鑒定及生化鑒定實驗結果和分子鑒定結果能很好的吻合，說明本研究鑒定結果準確可靠，鑒定結果如表4所示。

表4　各菌株鑒定結果Table 4　Identification result of each strain

圖3　供試菌株的聚類分析Fig.3　Cluster analysis of Bacterial Strain for Test

由表4的鑒定結果及圖3的聚類結果可知，不同來源的漿水所含的兼性厭氧菌具有相似性，如都含有能代謝產生乳酸的菌株，如采自甘南臨潭、蘭州安寧、慶陽環縣的漿水中都分離到了植物乳桿菌；采自慶陽環縣、中衛沙坡頭的漿水分離到了消化乳桿菌；而在甘南臨潭和蘭州安寧漿水中分別分離到了嬰兒雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌，除此而外，在天水秦安和蘭州安寧的漿水中分離到的無乳鏈球菌、瓊氏不動桿菌與中間鏈球菌也具有產乳酸的功能。前人研究結果顯示，這些菌都具有一定的益生作用，如乳桿菌不僅具有促進消化、預防消化道出血[11]的作用，還具有抵御幽門螺桿菌等致病菌感染的功效[12-13]；而雙歧桿菌則不僅能促進消化、修復胃腸功能，更具有降低血脂、延緩衰老以及抗癌等作用[14-15]。這一結果從微生物的角度證明了西北漿水確實具有良好的保健作用，也反應西北漿水具有進一步開發利用的潛力。同時，從另一方面，也可以看到，某些來源的漿水還存在某些有害雜菌的污染，如從采自甘南臨潭的樣品中分離到了類腐敗梭菌，中衛沙坡頭樣品分離到了水生棒桿菌和產氣腸桿菌以及蘭州安寧樣品中分離到的大腸彎曲桿菌，這可能是由于漿水原料污染或操作過程不規范以及貯存不當等多種原因引起，這反映了傳統漿水生產中存在的一些問題。值得特別指出的是：天水秦安樣品中未發現有害菌，這可能是由于該漿水源自工廠化的生產，操作較為標準。這從一個側面說明了規范生產過程對于漿水的必要性。

除上述外，表4的鑒定結果還可以看出，蘭州安寧樣品中分離到的兼性厭氧菌相對最多，有5種，分別為MLY-15、MLY-11、MLY-9、MLY-4、MLY-1，其益生菌也含蓋乳桿菌屬、雙歧桿菌屬以及鏈球菌屬等3個屬；其次是甘南臨潭樣品中分離到了4種兼性厭氧菌，分別為MGY-4、MGY-7、NGY-2、MGY-5；而慶陽環縣樣品分離到了3株兼性厭氧菌，分別為MQY-7、NQY-8、MQY-2；中衛沙坡頭樣品同樣分離到了3株兼性厭氧菌，其分別是MNY-2、MNY-1、MNY-7；天水秦安樣品分離得到2種兼性厭氧菌，分別是NTY-4和MTY-2。綜上，不同來源的漿水，其中所含的厭氧微生物種類有差別。分析其原因可能是由于不同地域群眾在制作漿水時所選的菜品和制作手法都有很大區別，如蘭州地區多采用芹菜作為主要原料，而甘南地區則習慣采用土豆和胡蘿卜為主要原料。在制作手法方面，慶陽地區多為投加生菜發酵，而甘南地區則將菜品煮熟后用于發酵。這些都可能是造成不同地域樣品微生物種類不同的因素，張宗舟等[2]的研究也得出了相似的結論。

3　討論

在蔬菜的發酵過程中，隨著發酵時間的變化，其中的微生物群落也發生改變。一般而言，只有處于發酵中期的蔬菜，其乳桿菌等有益菌群才占據主導地位，有害物質含量也最低、風味最佳，是最適宜食用的時期而處于發酵前期和后期的蔬菜都不適于食用[16]。因此，在漿水生產中選取適宜的食用期極為關鍵，前人在此方面進行了大量的研究，選用了亞硝酸鹽的含量、風味等各種指標來規范這一階段的選取，而筆者認為，在各種指標中，最直接和準確的莫過于漿水中兼性厭氧微生物的狀況。漿水目前尚缺乏這一方面的研究，而實現標準化的生產，這是必須要攻克的一個方面。

目前，漿水大多采用自然接種的方式實現發酵接種，這就很難根治有害菌污染的頑疾，近些年來，在發酵蔬菜領域，人工控制接種技術逐漸被采用，尤其在韓國、日本等發達國家，投放發酵劑發酵已有相當廣泛的應用[17]。在人工控制條件下，添加具有優良特性的菌種，不僅能避免有害菌的污染，更能提高發酵產品質量，是值得漿水產業借鑒的一種優秀方法。

4　結論

綜上，由研究結果可以看出，漿水中存在多種兼性厭氧微生物，且其大多為益生菌，從微生物學的角度說明了漿水是一種極具開發利用潛力的發酵食品；但另一方面，研究發現漿水中還存在某些有害菌的污染，分析其是由漿水制作中的不規范造成的，也說明進行標準化、規范化生產的必要性。另外，就不同樣本對比分析，發現不同產地漿水樣本中的兼性厭氧微生物種類具有相似性。

[1]孟憲剛，周鴿鴿，張麗珂.發酵蔬菜漿水中優勢好氧微生物的分離及鑒定[J].食品工業科技，2010，31（3）：222-224.

[2]張宗舟，陳志梅，鞏曉芳.漿水生產過程中微生物分析[J].中國釀造，2009（10）：29-31.

[3]張麗珂，周鴿鴿，孟憲剛.傳統發酵食品漿水中厭氧微生物分離鑒定初探[J].食品科技，2010，35（4）：39-41.

[4]張軼，王玉麗，陳曉前，等.傳統發酵食品-漿水中微生物的分離與初步鑒定[J].食品科學，2007，28（1）：219-222.

[5]何玲，羅佳，郭寧，等.漿水芹菜發酵過程中硝化還原酶活性和亞硝酸鹽含量的變化[J].西北農林科技大學學報，2007，35（9）：184-188.

[6]袁桂秀，林晨，江振友，等.改良的焦性沒食子酸法培養厭氧菌[J].濟南大學學報，1999，20（4）：24-25.

[7]李振高.土壤與環境微生物研究法[M].北京：科學出版社，2008：146-190.

[8]楊汝德.現代工業微生物學實驗技術[M].北京：科學出版社，2009：159-173.

[9]RE布坎南，E吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊[M].北京：科學出版社，1984.

[10]東秀珠，蔡妙英，等.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[11]熊濤，宋蘇華，黃錦卿，等.植物乳桿菌NCU116在模擬人體消化環境中的耐受力[J].食品科學，2011（11）：114-117.

[12]周剛，李之印，王仲略，等.乳桿菌LB散聯合三聯療法治療幽門螺桿菌感染的療效[J].中國新藥與臨床雜志，2011（5）：362-364.

[13]高源，張振，王寶香，等.嗜酸乳桿菌對感染人輪狀病毒乳鼠腸黏膜的保護作用[J].世界華人消化雜志，2011（28）：2963-2969.

[14]郭本恒.益生菌[M].北京：化學工業出版社，2004：213-215.

[15]康白.雙歧桿菌[M].大連：大連海事大學出版社，1998：10-12.

[16]顧金華.泡菜微生態研究及優良接種劑的研制[D].南京：南京農業大學，2011.

[17]陳仲翔，董英.泡菜工業化生產的研究進展[J].食品科技，2004（4）：33-35.

Isolation and identification of facultative anaerobes from northwestern jiangshui

LI Xue-ping，LI Jian-hong，MENG Xian-gang*，XIE Jia-jia
（College of Chemistry and Bioengineering Sciences，Lanzhou jiaotong University，Lanzhou 730070，China）

Jiangshui from different regions of northwestern China was obtained with multiple points sampling method and was used as the experimental material.The improved pyrogallic acid and spread-plate method were applied for separating and purifying of facultative anaerobic microorganism with getting 17 strains.The morphologic observation and the research of gram staining and biochemical characteristic，together with identification of 16S rDNA were used to analyze the purified strains.The major finding was that there were different sorts of facultative anaerobesin the Jiangshui，and most of them belong to Lactobacillus，Bifidobacterium or the other probiotics.And there also existed part of sundry bacteria and harmful bacteria.In addition，it was found that there was a significant difference of the kinds of the facultative anaerobic microorganism in Jiangshui produced in different places.

jiangshui；anaerobic bacteria；isolation；identification

TS201.3

A

1002-0306（2014）12-0213-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.038

2013－08－28*通訊聯系人

李雪萍（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物學。

2012甘肅省財政廳生物專項項目（213001）；2011甘肅省財政廳高等學校基本科研業務費項目（211135）。