豆腐致腐細菌的分離鑒定及控制研究

楊 明，陳信宇，張 輝，2，*，馮鳳琴，2，*（.浙江大學食品科學與營養學系，浙江杭州30058；2.浙江大學馥莉食品研究院，浙江杭州30058）

豆腐致腐細菌的分離鑒定及控制研究

楊 明1，陳信宇1，張 輝1，2，*，馮鳳琴1，2，*
（1.浙江大學食品科學與營養學系，浙江杭州310058；2.浙江大學馥莉食品研究院，浙江杭州310058）

對散裝老豆腐及盒裝內酯豆腐中腐敗細菌進行了分離鑒定，通過致腐細菌回接實驗進一步探究了豆腐腐敗現象與致腐細菌的關系，同時，測定了單月桂酸甘油酯（GML）、月桂酸蔗糖酯、δ-葡萄糖酸內酯、Nisin及其復合體系的最低抑制濃度和協同增效作用。結果表明，導致豆腐腐敗的細菌主要為短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和明串珠菌屬（Leuconostoc）；發酵乳桿菌、梨形腸桿菌及腸膜明串珠菌分別導致豆腐發粘、漲袋及質構變軟；GML對上述4種致腐細菌的抑制效果最佳；GML與Nisin復配增效效果最明顯，對類短短芽孢桿菌、發酵乳桿菌及腸膜明串珠菌均有協同增效作用。本文為研發添加于豆腐類產品的新型高效保鮮劑，延長其保質期奠定了基礎。

豆腐，致腐細菌，腐敗現象，單月桂酸甘油酯，最低抑菌濃度

豆腐起源于我國，是我國傳統的大豆食品，在全世界消費的所有植物中最具食用價值。大豆營養豐富，其蛋白質含量高達35%～40%，不僅富含不飽和脂肪酸、卵磷脂、腦磷脂、膳食纖維、低聚糖、鈣、磷、鐵等無機鹽及多種維生素，而且易消化，因而被譽為“植物肉”。經常食用豆腐，可降低血清總膽固醇，降血壓，降血糖，減少動脈硬化，同時對預防骨質疏松、預防癌癥及保護心血管健康也能起到良好的作用[1-3]。但是，大豆制品含有豐富的蛋白質和碳水化合物，水分活度較高且pH中性偏酸，為微生物提供了理想的生長繁殖環境，從而導致其保質期較短，影響了豆制品的品質和銷售，也在一定程度上限制了豆制品行業的發展[4]。

豆腐腐敗主要是由細菌引起的，雖然在加工過程中會受到各種細菌的污染，但最終只有部分細菌大量增殖，在腐敗中占據主導地位[5]。國內外學者均報道過引起豆腐腐敗變質的主要腐敗菌種類，但目前還沒有一致的結論。李博等[6]認為δ-葡萄糖酸內酯豆腐（GDL豆腐）的主要腐敗菌為堅強芽孢桿菌及屎腸球菌；鄧勇等[7]研究認為GDL豆腐中的主要腐敗菌為75%枯草芽孢桿菌和15%凝結芽孢桿菌。Fouad等[8]研究表明2～3℃保存的真空包裝豆腐中主要腐敗菌為乳酸菌、腸道菌和假單胞菌屬。Tuitemwong等[9]認為7℃保存的豆腐中腐敗菌主要為鏈球菌屬、發酵乳桿菌屬、陰溝梨形腸桿菌等。柳玉等[10]研究證明芽孢桿菌是造成豆制品腐敗的主要微生物。Dostson等[11]認為引起豆腐腐敗變質的主要腐敗菌為乳酸菌。

單月桂酸甘油酯（glycerol monolaurate，GML）天然存在于母乳和美洲蒲葵中，是一種親酯性的非離子型表面活性劑，兼具優良的乳化及防腐性能。GML是一種安全、高效、廣譜的抗菌劑，且其抑菌效果不受pH影響。有研究表明，GML能夠抑制HIV病毒、細胞巨化病毒、包疹病毒、sna病毒以及大量的細菌及原生動物[12]。此外，已有實驗證明，GML能有效抑制糯米糕團、低溫肉糜制品、月餅、冷鮮肉類、牛肉制品及奶制品中的腐敗微生物生長[13-16]。

本研究篩選并鑒定了散裝老豆腐及盒裝內酯豆腐中的主要腐敗菌種，并通過致腐細菌回接實驗探索了豆腐腐敗現象與致腐細菌之間的關系，同時，選取單月桂酸甘油酯等幾種有抑菌功能的食品添加劑對其進行體外抑菌研究，為研發添加于豆腐類產品的新型高效保鮮劑，延長其保質期奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

盒裝內酯豆腐、散裝老豆腐 市場購得，祖名豆制品股份有限公司；單月桂酸甘油酯（GML） 質量含量為80%，杭州康源食品科技有限公司；乳酸鏈球菌素 食品級，浙江新銀象生物工程有限公司；δ-葡萄糖酸內酯 食品級，安徽興宙醫藥食品有限公司；月桂酸蔗糖酯 食品級，日本三菱化學公司；其他試劑 均為國產分析純。

pH計（PB-10）、電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司；恒溫搖床、恒溫恒濕培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司；超凈工作臺 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；酶標儀 美國熱電雷勃公司；立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種分離純化 菌種分離純化的方法參考張希等[17]采用的方法。

1.2.2 菌株鑒定 菌種鑒定采用Sherlock全自動細菌鑒定系統，通過對不同菌株的脂肪酸圖譜進行分析，并與標準數據庫進行比對，進行菌株鑒定。

1.2.3 豆腐致腐細菌回接實驗 分別吸取1mL含菌量為104CFU/mL的四種致腐菌菌液，接種至裝有20～ 25g已滅菌樣品的真空塑封袋中，真空包裝。接菌后的樣品分別放置于室溫和37℃恒溫培養箱中，每個樣品重復3次。連續觀察樣品腐敗現象并記錄，同時，測定總酸的含量。測定總酸的方法如下：

根據GB/T 12456-90《食品中總酸的測定方法》進行總酸的測定。按照下式計算總酸度。

其中：C—標準NaOH溶液的濃度，mol/L；V—滴定消耗標準NaOH溶液體積，mL；m—樣品質量或體積，g或mL；V0—樣品稀釋總體積，mL；V1—滴定時吸取的樣液體積，mL；K—換算為主要酸的系數，即1毫摩爾氫氧化鈉相當于主要酸的克數。

1.2.4 抑菌劑最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定 先將菌種在37℃下培養1～ 2d，恢復菌種活力，再接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養基（tryptic soy broth，TSB）中進行搖床培養，37℃下培養18～24h后，采用平板計數法確定菌液濃度。

選取GML、δ-葡萄糖酸內酯及月桂酸蔗糖酯這3種在豆制品中允許使用且有抑菌功能的食品添加劑作為抗菌實驗的材料，并與天然強效抑菌劑Nisin作對比。為模擬豆制品中致腐菌的實際生長環境，將培養基pH調節至新鮮豆制品的pH，即6.25。

GML、δ-葡萄糖酸內酯、月桂酸蔗糖酯及Nisin的最低抑制濃度測定方法采用微量稀釋比濁法[17-19]。抑菌劑的稀釋采用兩倍稀釋法，其中Nisin先用0.01mol/L的HCl溶解，再用含HCl 0.0008mol/L的無菌TSB進行稀釋。1.2.5 GML復合體系抑菌效果測定 取2MIC（最低抑制濃度的2倍）、MIC、1/2 MIC這3個濃度的GML，依次與濃度分別為2MIC、MIC、1/2 MIC的其余3種抑菌劑進行復配，比例為1∶1，用酶標比濁法測定GML復合體系的抑菌效果，具體方法參考宋飛[20]采用的方法。培養基pH為6.25。

1.2.6 抑菌劑復配增效效果判定 增效效果判定公式：

FICI=MIC（a/a+b）/MICa+MIC（b/a+b）/MICb

其中，FIC—Fractional inhibitory concentrations，部分抑制濃度；FICI—FIC Index，部分抑制濃度指數；MIC（a/a+b）—抑菌劑a與b的復配物完全抑制某種微生物時，復配物中a的抑制濃度；MIC（b/a+b）—抑菌劑a與b的復配物完全抑制某種微生物時，復配物中b的抑制濃度；MICa—抑菌劑a對某種微生物的最低抑制濃度；MICb—抑菌劑b對某種微生物的最低抑制濃度。

若FICI＜1，則說明抑菌劑a與b復配后抑菌效果表現為協同增效作用；若FICI≥1，則說明抑菌劑a與b復配后抑菌效果表現為無協同增效作用（拮抗或疊加）[21]。

1.3 數據分析

采用單因素方差分析法對數據進行差異性比較（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定

分離純化后得到的四種菌株，分別標記為菌株A、菌株B、菌株C和菌株D。鑒定結果如表1所示，菌株A屬于短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）；菌株B屬于腸桿菌屬（Enterobacter）；菌株C屬于乳桿菌屬（Lactobacillus）；菌株D屬于明串珠菌屬（Leuconostoc）。

2.2 豆腐腐敗現象及總酸變化

為進一步確認分離純化得到4種微生物是否為豆腐的致腐菌，進行回接實驗，并初步探究致腐菌與豆腐腐敗現象的關系。豆腐是極易腐敗的食物，其腐敗變質的主要現象為發酸、發粘、產氣漲袋、質構變軟、發臭等。

由表2可知，在37℃保存條件下，隨著時間的變化，發酵乳桿菌的存在能導致老豆腐發粘，對內酯豆腐的影響則不明顯，這是因為內酯豆腐的主要腐敗現象并不是發粘；梨形腸桿菌產氣能導致兩種豆腐產生漲袋現象，且對老豆腐的影響更大，漲袋現象更加明顯；兩種豆腐質構變軟均與腸膜明串珠菌的存在有一定關系；類短短芽孢桿菌對兩種豆腐腐敗變質的影響不明顯，這可能是因為作為優勢菌種的類短短芽孢菌抑制了其他菌種的生長繁殖，破壞了豆腐腐敗的正常菌種環境，但會有一定的產氣漲袋現象，并有綠色斑點出現，這可能是由于有霉菌產生。在室溫保存條件下，兩種豆腐的腐敗趨勢于37℃下一致，只是腐敗過程較為緩慢。

表1 菌種A、B、C及D的Sherlock鑒定結果Table 1 Sherlock identification of A，B，C and D strains

表2 致腐菌接種豆腐的腐敗現象（37℃）Table 2 The spoilage situation of pathogens inoculation experiment（37℃）

微生物在生長過程中會產生酸，使豆腐腐敗變酸，通過測定豆腐總酸含量判斷豆腐腐敗情況，以及各種微生物產酸情況。由圖1、圖2可知，37℃，五種處理條件下，兩種豆制品（老豆腐及內酯豆腐）的總酸含量隨時間的變化呈現先升高后下降的趨勢。總體而言，空白組豆腐的總酸含量顯著大于分別添加類短短芽孢桿菌、腸膜明串珠菌、發酵乳桿菌及梨形腸桿菌的豆腐（p＜0.05），這可能是因為在4個陽性處理組中4種致腐菌均為優勢菌群，其他種類微生物生長緩慢且數量較少，破壞了豆腐的正常腐敗環境，而單一存在的致腐菌不能使豆腐快速腐敗變酸。與其他組相比，添加梨形腸桿菌的兩種豆腐制品總酸含量與空白組最為接近，在貯藏后期，添加其他3種致腐菌的處理組的總酸含量均顯著小于空白組，且這3個處理組間的總酸含量存在顯著性差異。結果表明，梨形腸桿菌可能是導致兩種豆腐變酸的主要菌種，其他3種致腐菌對老豆腐及內酯豆腐產酸現象沒有明顯影響。

圖1 致腐菌回接實驗總酸變化（老豆腐，37℃）Fig.1 Changes of total acid in pathogens inoculation experiment（firm tofu，37℃）

圖2 致腐菌回接實驗總酸變化（內酯豆腐，37℃）Fig.2 Changes of total acid in pathogens inoculation experiment（lactone tofu，37℃）

表3 常見抑菌劑對4種致腐菌的最低抑制濃度（pH=6.25）Table 3 MIC of common preservatives to four spoilage microorganisms（pH=6.25）

2.3 抑菌劑對四種致腐菌的最低抑制濃度

由表3可知，GML對4種致腐菌均有較強的抑制作用，尤其是類短短芽孢桿菌、發酵乳桿菌及腸膜明串珠菌。Cotton等[22]研究發現GML能有效抑制芽孢桿菌，GML對革蘭氏陽性菌的抑制作用明顯優于對革蘭氏陰性菌。Nisin對4種致腐菌的抑制效果與GML十分類似，對類短短芽孢桿菌、發酵乳桿菌及腸膜明串珠菌的MIC值分別為4、4和2μg/mL，對梨形腸桿菌的MIC值為1000μg/mL。羅欣等[23]發現Nisin能抑制引起食品腐敗的許多革蘭氏陽性細菌，如腸膜明串珠菌、發酵乳桿菌、葡萄球菌和小球菌等。月桂酸蔗糖酯對除梨形腸桿菌外的3種致腐菌抑制效果較好，MIC值小于或等于250μg/mL。δ-葡萄糖酸內酯對發酵乳桿菌及腸膜明串珠菌有一定的抑制作用，最低抑制濃度為2000μg/mL。

2.4 GML復合體系對四種致腐菌的最低抑制濃度

以GML為主體復配其他抑菌劑，采用微量稀釋比濁法，測定單月桂酸甘油酯復合體系對四種致腐菌的最低抑制濃度。

由表4可知，GML與Nisin復配后增效效果明顯，GML與Nisin的濃度分別為各自最低抑制濃度的1/4和1/8或1/8和1/4時，對類短短芽孢桿菌、發酵乳桿菌及腸膜明串珠菌均有協同增效作用；GML與δ-葡萄糖酸內酯復配后，只對類短短芽孢桿菌有協同增效效果（FICI=0.625），即GML與δ-葡萄糖酸內酯的濃度分別為1/4 MIC和1/2 MIC或1/2 MIC和1/8 MIC；GML與月桂酸蔗糖酯復配后對類短短芽孢桿菌（FICI= 0.5）、發酵乳桿菌（FICI=0.375）有協同增效效果，但對腸膜明串珠菌和梨形腸桿菌沒有表現出協同增效作用。結果表明，GML與Nisin復配后協同增效效果最好，對3種致腐菌起到協同抑制作用，其余復配方式只對其中1種或2種致腐菌起到協同增效作用。

3 結論

從腐敗變質的豆腐中分離得到的發酵乳桿菌、梨形腸桿菌及腸膜明串珠菌能分別導致豆腐發生發粘、漲袋及質構變軟等腐敗現象。在單一種類抑菌劑抑菌實驗中，GML的抑制效果與Nisin類似，對分離純化得到的4種豆腐致腐細菌均表現出較強的抑制作用，且明顯優于月桂酸蔗糖酯和δ-葡萄糖酸內酯；而GML與其余3種抑菌劑復配后均存在不同程度的協同增效作用，其中GML與Nisin復配后效果最佳。由本研究可知，GML作為一種安全高效的抑菌劑，可單獨或與其他抑菌劑復配后應用于豆腐類產品的防腐保鮮。

表4 GML與其余常用抑菌劑的復配抗菌活性（pH=6.25）Table 4 The combined antibacterial ability of GML and other commonly used antibacterials（pH=6.25）

[1]James W Anderson，Belinda M Smith，Carla S Washnock．Cardiovascular and renal benefits of dry bean and soybean intake[J].American Journal of Clinical Nutrition，1999，70（3）：464-474.

[2]王敏.非發酵性豆制品（豆腐絲）主要腐敗細菌的分離鑒定及其防腐研究[D].保定：河北農業大學，2004.

[3]谷大海，常青，劉華.豆腐的研究概況與發展前景[J].農產品加工，2009（6）：76-78.

[4]何麗華.豆制品防腐保鮮技術的研究進展[J].現代預防醫學，2007，34（2）：294-296.

[5]Thomas A，Meekin M，Thomas R．Shelf life prediction：status and future possibilities[J]．International Journal of Food Microbiology，1996，33：65-83.

[6]李博.GDL豆腐中的主要腐敗微生物的研究及HACCP的建立[D].北京：中國農業大學，2001.

[7]鄧勇，騰剛，陳蓮伊.盒裝豆腐腐敗菌的鑒定及其耐熱性的研究[J].中國食品學報，1998（3）：33-38.

[8]Fouad，K E.，Hegeman G D.Microbial spoilage of Tofu（soybean curd）[J].J Food Protect，1993，56（2）：157-164.

[9]Tuitemwong K，Fung D Y C.Microbiological study of Tofu[J]. J Food Protect，1991，54（13）：212-216.

[10]柳玉，郭順堂.微生物在大豆籽粒中的分布及其對豆制品加工的影響[J].大豆科學，2007，26（4）：578-579.

[11]Dostson C R，Frank H A，Cavaletto C C.Indirect methods as criteria of spoilage in tofu（soybean curd）[J].J Food Sci，1997，42：273-274.

[12]Hamosh M.Free fatty acids and monoglycerides：antiinfective agents produced during digestion of milk fat by the newborn，immunology of milk and the nonate[M].Mestecky，J.et al，eds，Plenum Press，NY，1991.

[13]馮鳳琴，杜鵑，王小劉.食品防腐乳化劑月桂酸單甘油酯及其在食品中的應用[J].中國食品添加劑，2009（S1）：173-177.

[14]宋飛，張希，李想，等.單甘油月桂酸酯及其復合保鮮劑對冷鮮肉保鮮效果的研究[J].食品工業科技，2012，33（15）：341-344.

[15]Evelyne M，Mary B.Antilisterial effects of free fatty acids and monolaurin in beefemulsionsand hotdogs[J].Food Microbiology，2004（21）：815-818.

[16]Maria B，Richard A H.Interaction of monolaurin，eugenol and sodium citrate on growth of common meat spoilage and pathogenic organisms[J].International Journal of Food Microbiology，1998，39：175-183.

[17]張希，何逸波，杜鵑，等.真空包裝年糕保鮮劑研究[J].浙江大學學報：農業與生命科學版，2013，39（2）：209-214.

[18]Zhang H，Zhang L，Peng L J，et al.Quantitative structureactivity relationship of antimicrobial fatty acids and derivatives against Staphylococcus aureus[J].Journal of Zhejiang University Science B，2012，13（2）：83-93.

[19]Branenl J K，Davidson P M.Enhancement of Nisin，lysozyme，and monolaurin antimicrobial activities by ethylenediaminetetraacetic acid and lactoferrin[J].International Journal of Food Microbiology，2004，90：63-74.

[20]宋飛.單月桂酸甘油酯在冷鮮肉保鮮中的應用研究[D].濟南：山東輕工業學院，2012.

[21]Parish M E，Davidson P M.Methods for evaluation Antimicrobials in Foods[M].NY：Marcel Dekker，1993：597-615.

[22]Cotton L N，Marshall D L.Monolaurin preparation method affects activity against vegetative cells of Bacillus cereus[J]. LWT-Food Science and Technology，1997，30（8）：830-833.

[23]羅欣，朱燕.Nisin在牛肉冷卻肉保鮮中的應用研究[J].食品科學，2000，21（3）：53-57.

Separation，identification and control of spoilage bacteria in tofu

YANG Ming1，CHEN Xin-yu1，ZHANG Hui1，2，*，FENG Feng-qin1，2，*
（1.School of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China；2.Fuli Institute of Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China）

In this study，spoilage microorganisms were separated and characterized from firm tofu in bulk and boxed lactone tofu，the relationship between spoilage phenomena and putrefaction-making bacteria was preliminarily studied through pathogens inoculation experiments.Meanwhile，four food additives with bacteriostatic function were chosen to inhibit the spoilage microorganisms，including glycerol monolaurate（GML），sucrose monolaurate，glucono-δ-lactone and Nisin.The minimum inhibitory concentrations（MIC）of each antibacterial agent and synergistic effects between GML and other antimicrobial agents were measured.Result showed that there were four kinds of spoilage microorganisms which led to corruption of tofu：Brevibacillus，Enterobacter，Lactobacillus and Leuconostoc.The first three strains could cause clamminess，sack expanding and softening of tofu respectively.Antibacterial activities of GML or Nisin against each spoilage microorganism mentioned above were better than others.The synergistic effect of GML and Nisin was the best，especially for Brevibacillus，Lactobacillus and Leuconostoc.This paper would lay a foundation of future study on new and efficient preservative added to tofu to prolong the shelf life.

Tofu；spoilage microorganisms；spoilage phenomena；glycerol monolaurate（GML）；minimum inhibitory concentration

TS201.1

A

1002-0306（2014）12-0218-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.039

2013－11－19 *通訊聯系人

楊明（1990-），女，碩士研究生，研究方向：食品添加劑。

國家自然科學基金（31071501）；植物食品加工技術科技創新團隊（2010R50032）。