騰沖嗜熱厭氧菌耐熱解旋酶Tte-uvrD的克隆表達及粗酶的初步應用

章 麗，余以剛，黃秀麗，肖性龍，*（.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州50640；.廣東省惠州市質量計量監督檢測所，廣東惠州56000）

騰沖嗜熱厭氧菌耐熱解旋酶Tte-uvrD的克隆表達及粗酶的初步應用

章 麗1，余以剛1，黃秀麗2，肖性龍1，*
（1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640；2.廣東省惠州市質量計量監督檢測所，廣東惠州516000）

以騰沖嗜熱厭氧菌（Thermoanaerobacter tengcongensis）基因組DNA為模版，通過PCR克隆編碼解旋酶Tte-uvrD的基因tte-uvrd，將該基因插入原核表達載體pET-32a（+），構建重組表達載體pET-32a（+）-tte-uvrd，轉入E.coli BL21中，經藍白斑篩選和雙酶切法篩選陽性重組轉化子，挑取測序正確的單個陽性菌落，在IPTG誘導下表達出重組蛋白Tte-uvrD。誘導后的菌體經超聲破碎和離心，上清液用硫酸銨沉淀法初步純化，透析除鹽，凍干復溶后得到粗酶液。用tHDA反應來驗證Tte-uvrD粗酶液的活性，比較不同儲存溫度下粗酶液酶活保持的時間，并比較-20℃下儲存兩個月的粗酶液與商品化純酶的tHDA反應靈敏度。結果表明，用本研究建立的克隆方法可成功克隆出耐熱解旋酶TteuvrD，其粗酶液能用于tHDA反應，說明粗酶液具有解旋活性；粗酶液在-20℃下第80d酶活仍能保持穩定，4℃下則只能保持酶活約一周；-20℃下儲存兩個月的粗酶液能達到與商品化純酶相當的靈敏度。

騰沖嗜熱厭氧菌，Tte-uvrD，克隆表達，粗酶，tHDA

依賴解旋酶的恒溫基因擴增（helicase-dependent isothermalDNA amplification，HDA）是美國New England Biolabs的研究人員模擬動物體內DNA的復制機制發明的一種新的體外恒溫基因擴增技術[1]，HDA模擬自然界生物體內DNA復制的自然過程，由解旋酶UvrD解開雙鏈DNA，在MutL的輔助下，依靠單鏈DNA結合蛋白SSB與模板單鏈結合，使模板單鏈處于單鏈狀態并保護它的完整性，然后由DNA聚合酶催化合成互補鏈，雙鏈DNA產物作為底物進人下一輪擴增。而建立在此基礎上的tHDA（thermophilic HDA）則利用耐熱解旋酶Tte-uvrD代替UvrD從而達到不用SSB和MutL即可完成核酸等溫擴增的目的，目前tHDA已經應用于一些病原菌的檢測[2-4]，而該方法的關鍵在于耐熱解旋酶Tte-uvrD。目前國內尚未有關于如何制備Tte-uvrD的報道，美國Biohelix研發的Tte-uvrD克隆表達純化方法可得到純度及活性都較高的純酶[5]，并且已經開發成為商品化試劑盒，但由于商品化純Tte-uvrD酶的價格昂貴，限制了在實際檢測中的應用；而純酶的克隆表達純化方法又十分繁瑣且成本高。本研究以騰沖嗜熱厭氧菌基因組為模版克隆表達出Tte-uvrD蛋白，提取粗酶液并對其進行反應活性測定，對tHDA方法的發展有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

pET-32a（+）Vectors、E.coli BL211（DE3）、含副溶血性弧菌目的擴增片段的標準重組質粒PMD18-tox R和相應的引物對Primer 3和Primer 4 為筆者所在實驗室保藏；騰沖嗜熱厭氧菌基因組DNA 由中國科學院微生物研究所提供；PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4 DNA Ligase、DL2000TMDNA Marker、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0 TaKaRa公司；商品化純酶Tte-uvrD（20μg，0.5mg/mL） Biohelix公司；瓊脂糖、Gold View、LB培養基 廣州翔科儀器科技有限公司；IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）、X-Gal、氨芐青霉素、Evagreen、牛血清蛋白（BSA）、Bst Polymerase、dNTP 生工生物工程（上海）有限公司；其他常用試劑 均為分析純。

TC-25/H基因擴增儀 杭州博日科技有限公司；DYY-6C電泳儀 北京市六一儀器廠；7500 Real Time PCR System（帶HRM模塊） 美國Applied Biosytems公司；低溫微量超速離心機Centrifuge 5804 R 德國Eppendorf公司；Milli-Q超純水系統 美國Millipore Corp公司；Spectrumlab 752s紫外可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞粉碎機 上海喬躍電子有限公司；pH檢測計PHS-3C 上海雷磁創益儀器儀表有限公司；NSKY-211B恒溫培養振蕩器 上海蘇坤實業有限公司，LRH-250A-Ⅱ生化培養箱 韶關市泰宏醫療器械有限公司；WD-9403B紫外儀 北京市六一儀器廠，ULT 1386-3-V41超低溫冰箱 美國ThermoFisher Scientific公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司。

1.2 引物設計與合成

本研究根據美國國家生物信息中心（NCBI）上已公布的Thermoanaerobacter tengcongensis的Tte-uvrd基因序列（Gene Bank Reference Sequence：NC_003869.1），采用Primer Premier 5.0引物設計軟件，并利用NCBI網站上的BLAST進行序列比較和同源性分析，自主設計一對特異性擴增引物如下：上游引物Primer 1：PTYNde pf 5’-ATAGGATCCATGATTGGAGTGAAAA AGATGAA-3’（包含一個BamHⅠ酶切位點）；下游引物Primer 2：TCUVRDPR 5’-AAACTCGAGTTAAGAA ATTGCCTTAATAGGAG-3’（包含一個XhoⅠ酶切位點）。預計擴增片段大小為2142bp，引物由TaKaRa公司合成。

1.3 Tte-uvrd的克隆及序列分析

以騰沖嗜熱厭氧菌基因組DNA為PCR擴增的模版，反應體系（50μL）為：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+plus）10μL，dNTP Mixture（各2.5mmol/L）4μL，Primer 1（10μmol/L）1μL，Primer 2（10μmol/L）1μL，模版DNA1μL（＜200ng），PrimeSTAR?HS DNA Polymerase（2.5U/μL）0.5μL，滅菌重蒸水32.5μL，混勻。PCR反應條件：98℃預變性10s，98℃變性10s，55℃退火5s，72℃延伸2min，進行30個循環，72℃延伸10min。取PCR產物1μL進行1%瓊脂糖凝膠電泳，用Gold view染色后進行紫外檢測，得到的目的條帶（約2kbp）。用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0對50μL PCR反應液進行切膠回收。

1.4 Tte-UvrD的克隆表達

目的基因片段tte-uvrd和載體pET-32a（+）的雙酶切均用限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切。酶切體系（20μL）為：目的基因片段或質粒10μL，10×K Buffer 2μL，BamHⅠ1μL，XhoⅠ1μL，ddH2O補齊至20μL；37℃下酶切1h。酶解液進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用1.3中方法進行切膠回收DNA。回收目的基因片段后，以T4 DNA連接酶進行連接，載體與目的基因片段的摩爾數之比為1∶10，連接體系（25μL）為：10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5μL，DNA片段10μL，載體DNA 4μL，T4 DNA Ligase 1μL，dH2O補齊至25μL；22℃連接過夜。將構建的重組表達載體pET-32a（+）-tte-uvrd轉化至E.coli BL21感受態細胞中，涂布有IPTG及X-Gal的含氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37℃培養過夜，進行藍白班篩選，選取白色菌落，提取陽性轉化子進行雙酶切鑒定，將雙酶切鑒定正確的陽性轉化子送上海生工生物技術有限公司進行測序，測序引物采用上述Primer 1和Primer 2。堿基序列的比對在美國國立生物技術信息中心（NCBI）網站的BLAST軟件上進行。

挑取前述經測序正確的單個陽性菌落接種到含50μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃，200r/min培養至OD600值達到0.5～0.6，加入終濃度為1mmol/L的IPTG于37℃，200r/min條件下培養3h。12000r/min離心1min收集菌體，保存于-80℃。

1.5 粗酶液的制備

菌體以50mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液（pH8.0）洗滌3次，按3mL緩沖液+1g菌體的比例配成菌懸液，置于0℃的冰-水混合水浴中10min，用SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞粉碎機（400W）超聲波破碎處理99次，每次5s，間隔5s。4℃下以12000r/min離心15min，收集上清液，添加飽和（NH4）2SO4溶液使終濃度達80%，4℃鹽析過夜。經12000r/min離心30min得到粗酶沉淀，復溶于pH7.0的0.05mol/L磷酸緩沖液中，透析至無硫酸根，透析完的酶進行冷凍干燥12h制成粗酶粉，復溶于20mmol/L Tris-HCl，pH7.4，200mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，1mmol/L二硫蘇糖醇，50%（v/v）甘油的緩沖液中，即為粗酶液。粗酶液中蛋白的濃度采用Bradford檢測法[6]，即以BSA作為標準蛋白表示，再將粗酶液濃度調整到160ng/μL。將粗酶液小量分裝于-20℃貯存備用。

1.6 Tte-UvrD粗酶的初步應用

將剛提取的Tte-UvrD粗酶液應用到tHDA反應中，觀察其反應活性。選取副溶血性弧菌為目標檢測對象，以tox R為靶基因，引物對及模版（PMD18-tox R）制備參考之前的研究[7]，目的擴增段長度為79bp，理論Tm值為77.8℃。tHDA反應體系（50μL）為：Bst Polymerase 0.8U，10×Annealing bufferⅡ（200mmol/L Tris，pH8.8 and 100mmol/L KCl）5μL，MgSO4（100mmol/L）2μL，NaCl（500mmol/L）4μL，dNTP（10mmol/L）3.5μL，DNA template（3.50×107copies/mL）2μL，上游引物Primer 3（10μmol/L）1μL，下游引物Primer 4（10μmol/L）1μL，Tte-UvrD粗酶液3.5μL，20×EvaGreen 0.5μL，ddH2O補齊至50μL。反應程序為：63℃5s，62℃55s，進行40個循環；熔解程序為：95℃2min，60℃2min，60℃1s，然后升溫至95℃（0.1℃采集一次熒光），最后50℃冷卻，溶解速率為0.2℃/s。

1.7 粗酶液的穩定性實驗

選取濃度分別為3.50×103copies/mL和3.50× 105copies/mL的標準重組質粒PMD18-tox R為檢測對象，將粗酶液分別置于4℃和-20℃下，每隔一段時間取出檢測酶活，以tHDA反應能檢出PMD18-tox R的Ct值為酶活標準，觀察Tte-UvrD粗酶液酶活在不同貯存溫度下隨時間的變化。

1.8 粗酶液與純酶的tHDA反應靈敏度比較

比較Tte-UvrD粗酶液與商品化Tte-UvrD純酶的tHDA反應靈敏度。Tte-UvrD粗酶液選取于-20℃下保存兩個月Tte-UvrD粗酶液，以標準重組質粒PMD18-tox R為檢測對象，用雙蒸水將初始拷貝數為3.50× 107copies/mL的重組質粒按照1∶10的比例梯度稀釋，稀釋成3.50×101～3.50×107copies/mL七個梯度，取1μL各個稀釋度作tHDA分析，以反應能檢測出的最低DNA量為該體系的檢測靈敏度，每個樣本設置3個復孔及1個陰性對照孔。

2 結果與討論

2.1 tte-uvrd基因的克隆

用PCR從古細菌T.tengcongensis的基因組中克隆了編碼Tte-uvrD酶的讀碼框基因序列，結果見圖1。從電泳圖上可見一條清晰的擴增條帶約為2.2kbp，大小與預期（2142bp）相符合。由于擴增所用引物的5′端添加了限制性酶切位點及一些保護堿基，因而擴增得到的片斷比目的基因稍大，根據電泳結果初步判斷擴增片斷即為tte-uvrd基因。

2.2 陽性重組子質粒DNA雙酶切鑒定

將該序列連接到載體pET-32a（+）上，轉化至E.coli BL21感受態細胞中，經X-Gal篩選出來的陽性克隆菌后，提取重組質粒pET-32a（+）-tte-uvrd，經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，結果見圖2。泳道1和2經雙酶切的重組質粒釋放約6.0kbp和約2.0kbp大小的片段，分別對應pET-32a（+）和tte-uvrd的大小，泳道3空質粒的陰性對照顯示沒有目的片段，由此初步判定獲得陽性重組子。將酶切鑒定正確的重組質粒進行雙向測序，測序結果表明，其擁有一個2142bp的完整開放閱讀框（ORF），與GenBank中公布的tte-uvrd基因序列一致。BLAST同源序列比對結果顯示兩者同源性為100%，表明tte-uvrd基因成功克隆pET-32a（+）。

圖1 tte-uvrd PCR擴增產物電泳圖譜Fig.1 Detection of tte-uvrd PCR products in agarose gels

圖2 重組表達載體pET-32a（+）-tte-uvrd的雙酶切鑒定Fig.2 Screening of recombinant plasmids with double digestion

2.3 粗酶液的制備

將經測序正確的重組菌株轉接到含氨芐青霉素的LB發酵培養基中，當菌體生長到對數期后，加入IPTG誘導實現了高效分泌表達，為該酶的后續定向研究及應用奠定了良好基礎。本著盡量從上清液分離出酶，又不使酶變性的原則，將菌體超聲破碎離心后，用硫酸銨沉淀法得到粗酶沉淀，用磷酸緩沖液透析至無硫酸根，凍干制成粗酶粉再溶解于緩沖液中，得到粗酶液。實驗表明，添加的（NH4）2SO4終濃度為80%時，可完全沉淀酶蛋白。由于Tte-uvrD的最適反應溫度在63℃左右，若采取45℃干燥法制備粗酶粉對酶活會造成一定的損失，故采用冷凍干燥法以提高酶活得率。用Bradford檢測法測得粗酶液中蛋白含量約為300ng/μL，再將粗酶液濃度調整為160ng/μL。

2.4 粗酶液的初步應用

由圖3可見，將Tte-UvrD粗酶液應用于tHDA反應中，能得到很好的擴增曲線、特異性的溶解曲線和熔點峰，熒光信號值增量大，熔點峰尖呈“犀牛角”狀，峰基底較窄，熔解曲線平滑呈陡直急劇下降。HRM曲線峰Tte-UvrD粗酶液能發揮較高的解旋活性，可很好地完成目的基因的擴增。

圖3 Tte-UvrD粗酶液檢測副溶血性弧菌的tHDA-HRM圖Fig.3 tHDA-HRM result on VP of Tte-UvrD crude enzyme

2.5 粗酶液的穩定性實驗

由圖4可知，Tte-UvrD粗酶液的穩定性實驗結果表明，在4℃及-20℃下儲存時，對于相同濃度的模版，測得的Ct值隨著儲存時間的延長呈現逐漸變大的趨勢，表明Tte-UvrD粗酶液的酶活隨著儲存時間的延長酶活稍有降低。對3.50×103copies/mL和3.50× 105copies/mL兩個不同濃度的標準重組質粒PMD18-tox R的檢測結果均表明，4℃下儲存時，Tte-UvrD粗酶液在第9d均已失活；而-20℃下儲存時，粗酶液在第80d酶活還能保持穩定，第120d還有活性但活性稍有降低，說明Tte-UvrD粗酶液的酶活在低溫下更穩定。

圖4 不同儲存溫度下Tte-UvrD粗酶液活性隨時間的變化Fig.4 Activity of the Tte-UvrD crude enzyme in different temperature

表1 Tte-UvrD粗酶液和純酶用tHDA-HRM法檢測副溶血性弧菌靈敏度的比較Table 1 Sensitivities for detection of VP in tHDA-HRM assay by Tte-UvrD crude enzyme and pure enzyme

2.6 粗酶液與商品化純酶的反應靈敏度比較

由粗酶液的穩定性實驗可知，-20℃下儲存時，粗酶液在第80d酶活還能保持穩定，故選用-20℃下儲存兩個月的粗酶液與商品化純酶進行tHDA反應活性比較。由表1可見，Tte-UvrD粗酶液于-20℃下保存兩個月后，對于相同濃度的模版，其tHDA反應活性與商品化純Tte-UvrD酶相比，雖然能檢出的Ct值稍高于商品化純酶，但能達到同等的靈敏度，具有很好的相似性，表明粗酶液中的Tte-UvrD酶在目標菌株的DNA模版的解旋過程中起到了重要作用。本實驗選取的緩沖液組份為20mmol/L pH7.4 Tris-HCl，200mmol/L KCl，1mmol/L EDTA，1mmol/L DTT，50%（v/v）甘油，其中巰基保護劑DTT可阻止蛋白質中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質分子內或分子間二硫鍵，保護酶分子上的還原性基團，其抗氧化作用可起到保證Tte-uvrD解旋酶酶活的作用。EDTA可螯合金屬離子防止蛋白酶對酶的降解，從而穩定酶活。提取好的粗酶液小量分裝可減少使用時的污染，也能防止反復凍融使酶活降低。

3 結論與討論

隨著人們對核酸等溫擴增技術研究的不斷深入，HDA技術已經成為一個新的研究熱點。HDA技術依賴解旋酶解開DNA雙鏈，相比其他核酸擴增技術而言，體系更簡單，設計更簡便，可恒溫反應，大大降低成本，非常靈敏且技術特異性強，便于普及應用。而Tte-uvrD耐熱解旋酶相比UvrD而言，可以在更高的溫度范圍內（60～65℃）維持高活性，且不需輔助蛋白和單鏈結合蛋白，為其在更苛刻的環境中發揮作用提供了條件。因此研發出簡便的Tte-uvrD克隆表達純化方法將為Tte-uvrD在等溫核酸擴增的應用提供更多的發展空間。

在表達載體的構建中，本研究選用了高效表達的pET-32a（+）載體，pET-32a（+）是pET載體系統成員，該系統是目前在E.coli中克隆表達重組蛋白功能最強大的系統，克隆表達體系簡便易操作，提取能保持酶活長達四個月的粗酶液，從而省略了繁瑣的蛋白純化過程，大大降低了提取成本，具有良好的開發應用潛力。由于常規的解旋酶活性測定方法繁瑣且需要用到放射性物質[8]，造成一定的不安全因素，故本研究將Tte-uvrD粗酶液直接應用于tHDA反應體系中，用tHDA反應活性來反映Tte-uvrD粗酶液的解旋活性。結果表明本研究的純化儲存方法可獲得具有較高解旋活性的Tte-UvrD粗酶液，還可有效減少分離及初步純化過程中Tte-UvrD活性的降低，在-20℃下儲存兩個月后其tHDA反應活性與商品化純Tte-UvrD酶相比能達到同等的靈敏度，表明粗酶液中的Tte-UvrD酶在目標菌株的DNA模版的解旋過程中起到了重要作用。

下一步的研究方向是，研發能達到類似或更高的酶活的更簡便的粗酶提取或純化改進方法，如可考慮采用真空濃縮、低溫噴霧干燥等工藝來降低溫度對酶活的影響以提高酶活得率；以及研發出能保持粗酶液的反應活性的延長粗酶液保存時間的酶貯存液。

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Clone of Tte-uvrD from Thermoanaerobacter tengcongensis and activity of crude enzyme

ZHANG Li1，YU Yi-gang1，HUANG Xiu-li2，XIAO Xing-long1，*
（1.College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.Huizhou Quanlity and Measuring Supervision Testing Institute，Huizhou 516000，China）

In order to obtain the crude Tte-uvrD helicase，gene tte-uvrd was amplified from Thermoanaerobacter tengcongensis by PCR，and was cloned into prokaryotic expression vector pET-32a（+）.Apart from screening by the X-Gal method and double restriction enzyme digestion method，a two-direction sequencing was performed.The recombined vectors pET-32a（+）-tte-uvrd was transformed to E.Coli BL21 strains and were induced by IPTG.The crude enzyme of Tte-uvrD was obtained by ultrasonication，centrifugation，sedimentation of saturation ammonium sulfate，dialysis and freeze-drying.The tHDA reactions were conducted to verify the activity of crude enzyme，as well as to compare the activity between crude enzyme and commercial pure enzyme.Activities of crude enzyme in different storage temperetures were also compared.The results showed that tte-uvrd gene was successfully cloned and Tte-uvrD helicase was expressed.The crude enzyme displayed a good activity in the tHDA assay，indicating that the helicase had the unwinding activity and the activity stays stable for about 80d in-20℃，but only about one week in 4℃.The crude enzyme displayed a similar sensitivity as the commercial pure enzyme after stored in-20℃for 80d.

Thermoanaerobacter tengcongensis；Tte-uvrD；clone；crude enzyme；tHDA

TS207.4

A

1002-0306（2014）12-0226-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.041

2013－08－29 *通訊聯系人

章麗（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：微生物檢測。

國家自然科學基金青年科學基金資助項目（31101279）；教育部高等學校博士學科點專項科研基金新教師類資助課題（20110172120034）；廣東省科技計劃資助項目（2011B020314004）；華南理工大學中央高校基本科研業務費重點項目（2013ZZ068）；惠州市科技計劃項目（0031939140712048）。