響應(yīng)面法優(yōu)化微波超聲雙輔助提取金銀花綠原酸工藝

尤秀麗，池路花，曹蕓梅，鄭建忠，譚昌會（閩南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，福建漳州363000）

響應(yīng)面法優(yōu)化微波超聲雙輔助提取金銀花綠原酸工藝

尤秀麗，池路花，曹蕓梅，鄭建忠，譚昌會
（閩南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，福建漳州363000）

以金銀花為原料，采用微波超聲雙輔助提取綠原酸。通過單因素實驗對乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間、料液比、微波功率、微波時間等工藝參數(shù)進行研究，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，建立二次多項數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明，單因素和響應(yīng)面優(yōu)化金銀花綠原酸的最優(yōu)工藝參數(shù)為：微波功率400W、微波時間94s、液料比42∶1mL/g、乙醇濃度70%、超聲溫度為60℃、超聲時間60min，此條件下金銀花綠原酸提取率為5.45%。

響應(yīng)面法，微波超聲雙輔助提取，金銀花，綠原酸

金銀花，又名銀花、金花、忍冬花、金藤花等，為忍冬科常綠纏繞藤本忍冬的花蕾，主要分布在我國的山東、河南、河北等地，是國家首批頒布的既是食品又是藥品的60種中藥之一[1]，具有清熱解毒，涼散風(fēng)熱等功效[2-3]。金銀花的主要有效成分之一為綠原酸，是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑代謝產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物。綠原酸是一種強抗氧化性的新型活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等藥理作用[4-7]。現(xiàn)代科學(xué)對綠原酸生物活性的研究已深入到食品、保健、醫(yī)藥和日用化工等多個領(lǐng)域[8-10]。因此，眾多科學(xué)家對綠原酸的應(yīng)用價值與其提取方法具有濃厚的興趣。

傳統(tǒng)提取綠原酸的方法有水提法[11]、醇提法[12]，其被廣泛應(yīng)用，但存在耗時長、提取率低等缺點。近年來，隨著微波技術(shù)和超聲波提取技術(shù)的發(fā)展，因設(shè)備簡單、操作快捷、適用范圍廣、提取率高、溶劑用量少、節(jié)時、節(jié)能、安全污染小等優(yōu)點，被廣泛用于天然植物有效成分的提取[13-22]。但使用響應(yīng)面法優(yōu)化微波-超聲雙輔助從金銀花中提取綠原酸的工藝研究還鮮有報道[23-25]。因此，本文采用微波-超聲雙輔助乙醇提取金銀花中的綠原酸，采用單因素及響應(yīng)面法實驗分析的方法，以綠原酸提取率為考察指標(biāo)，以回歸分析確定金銀花綠原酸的最佳工藝條件，為綠原酸的進一步開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花 漳州紫金藥店，避光保存罐備用；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)樣品 中國生物制品研究所；無水乙醇 分析純。

P70D20TP-C6（WO）微波爐 廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司；BS110S電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；UV-1800 PC紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；XFB-200藥材粉碎機 吉首市中湘制藥機械廠；

SJIA-10N真空冷凍干燥器 寧波市鄞州雙嘉儀器有限公司。

1.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的曲線繪制

準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)樣品5.0mg，用50%乙醇定容至50mL，配制成0.1mg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別準(zhǔn)確量取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL比色皿中，用等濃度的乙醇定容。用紫外-可見分光光度計，在波長328nm處測定溶液的吸光度，并以綠原酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 金銀花中綠原酸的微波超聲雙輔助提取

將所購的金銀花置于60℃恒溫干燥箱中，待烘干后，用藥材粉碎機粉碎，過80目篩，得金銀花粉末。稱取金銀花粉末1.0000g，置于微波容器內(nèi)，加入一定量乙醇溶液作溶劑，浸泡12h，然后設(shè)定一定的微波功率、微波時間，將處理后的微波容器置于超聲波器皿中，在一定的超聲溫度、超聲時間、液料比提取，后冷后過濾提取液，濾液轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加相應(yīng)濃度乙醇定容。精密吸取濾液0.2mL用乙醇定容至10mL的比色管中，在波長328nm下測其吸光度，然后由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品的綠原酸提取率。

式中：C—標(biāo)準(zhǔn)曲線綠原酸的濃度（μg/mL）；n—稀釋倍數(shù)；V—配成溶液體積（mL）；W—金銀花的質(zhì)量（g）。

1.4 單因素實驗設(shè)計

以綠原酸提取率為指標(biāo)，準(zhǔn)確稱取金銀花粉末1.0000g，選取乙醇濃度、超聲溫度、超聲時間、料液比、微波功率和微波時間作為影響金銀花綠原酸微波超聲雙輔助提取的單因素，每組實驗重復(fù)5次，取其平均值。

1.5 響應(yīng)面實驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，選擇影響銀花綠原酸提取率的3個主要影響因素：微波功率、微波時間和料液比進行響應(yīng)面組合實驗，實驗自變量因素編碼及水平設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken實驗自變量因素水平表Table 1 Variables and levels for the Box-Behnken experimental design

1.6 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 7.0軟件和Origin 7.5 Professional軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

用紫外-可見分光光度計，在波長328nm處測定溶液的吸光度，并以綠原酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0620x+0.0225，R2=0.9998。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對金銀花綠原酸提取率的影響 當(dāng)微波功率400W，微波時間30s，超聲溫度60℃，超聲時間60min，液料比40∶1mL·g-1，考察乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%對綠原酸提取率的影響。結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇濃度對綠原酸提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of chlorogenic acid

從圖2可以看出，在乙醇濃度為50%～70%之間，綠原酸的提取率隨乙醇濃度的增大而增加，當(dāng)乙醇濃度為70%時提取率達到最大為4.48%，這可能是因為金銀花中綠原酸的極性更接近濃度為70%的乙醇的極性；隨著乙醇濃度的進一步增大，綠原酸提取率反而下降，可能因為綠原酸結(jié)構(gòu)中含有多個親水性的羥基基團，隨著乙醇濃度的增大，含水量減少，綠原酸的溶解度反而下降。因此，實驗選取乙醇的最佳濃度為70%。

2.2.2 超聲溫度對金銀花綠原酸提取率的影響 當(dāng)微波功率400W，微波時間30s，超聲時間60min，液料比40∶1mL·g-1，乙醇濃度70%，考察超聲溫度30、40、50、60、70℃對綠原酸提取率的影響。實驗結(jié)果見圖3。

圖3 超聲溫度對綠原酸提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment temperature on the extraction yield of chlorogenic acid

從圖3可見，金銀花綠原酸的提取率隨著超聲溫度的升高而增大，當(dāng)超聲溫度為60℃時，金銀花綠原酸的提取率達到最大值；提取溫度大于60℃后，金銀花綠原酸的提取率開始下降。其原因是隨著溫度升高，加快分子運動速度，從而使溶出物增多、綠原酸釋放加快，提取率增大；若是超聲溫度過高，綠原酸的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易被氧化分解，而使提取率下降。因此，實驗選定60℃為最佳超聲溫度。

2.2.3 超聲時間對金銀花綠原酸提取率的影響 當(dāng)微波功率400W，微波時間30s，液料比40∶1mL·g-1，乙醇濃度70%，超聲溫度60℃，考察超聲時間40、50、60、70、80min對綠原酸提取率的影響。結(jié)果見圖4。

圖4 超聲時間對綠原酸提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on the extraction yield of chlorogenic acid

由圖4可知，隨著超聲時間的延長，綠原酸提取率也隨之升高，當(dāng)超聲時間大于60min后，提取率反而呈下降的趨勢，這可能是因為長時間的提取會使綠原酸物質(zhì)發(fā)生部分降解，因此，選取最佳超聲時間為60min。

2.2.4 液料比對金銀花綠原酸提取率的影響 當(dāng)微波功率400W，微波時間30s，乙醇濃度70%，超聲溫度60℃，超聲時間60min，考察液料比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1mL·g-1對綠原酸提取率的影響。結(jié)果見圖5。

由圖5可以看出，隨著液料比從20∶1增加到40∶1，綠原酸的提取率增加幅度較大，這可能是因為隨著溶劑用量的增加，兩相間的濃度差增大，傳質(zhì)推動力提高，使金銀花的綠原酸充分溶出，提高提取率。當(dāng)液料比大于40∶1時，提取率反而下降，可能是因為溶劑量過大金銀花中的親水物質(zhì)大量溶出而影響綠原酸提取率，而且溶劑量過大會增加成本及后續(xù)液體濃縮的難度，因此，實驗選取液料比40∶1較為適合。

圖5 液料比對綠原酸提取率的影響Fig.5 Effect of olid-to-solvent ratio on the extraction yield of chlorogenic acid

2.2.5 微波功率對金銀花綠原酸提取率的影響 當(dāng)微波時間30s，乙醇濃度70%，超聲溫度60℃，超聲時間60min，液料比40∶1mL·g-1，考察微波功率100、150、400、550、700W對綠原酸提取率的影響。結(jié)果見圖6。

圖6 微波功率對綠原酸提取率的影響Fig.6 Effect of microwave power on the extraction yield of chlorogenic acid

由圖6可知，隨著微波功率從100W增加到400W，綠原酸的提取率增加幅度較大，這可能是因為隨著微波功率的增大，強大的內(nèi)壓及分子間的摩擦力使金銀花細胞破裂，綠原酸溶解速度加快，提取率升高；微波功率過大，溫度較高，不穩(wěn)定的綠原酸的鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)易被氧化分解，從而使提取率下降。因此，實驗選取最佳微波功率為400W。

2.2.6 微波時間對金銀花綠原酸提取率的影響 當(dāng)微波功率400W，乙醇濃度70%，超聲溫度60℃，超聲時間60min，液料比40∶1mL·g-1，考察微波時間30、60、90、120、150s對綠原酸提取率的影響。結(jié)果見圖7。

由圖7可知，隨著微波時間的延長，綠原酸提取率也隨之升高，當(dāng)微波時間大于90s后，提取率反而呈下降的趨勢。可能是因為隨著時間的增加，體系溫度會不斷升高，由于乙醇溶液沸點較低，體系溫度的不斷升高將導(dǎo)致爆沸，溶劑氣化回流量加大，最終導(dǎo)致溶劑揮發(fā)加劇，從而使綠原酸提取率降低，故實驗選取微波時間90s較為適合。

圖7 微波時間對綠原酸提取率的影響Fig.7 Effect of microwave time on the extraction yield of chlorogenic acid

2.3 響應(yīng)面法實驗結(jié)果與分析

利用Design Expert 7.0軟件中的Box-Behnken設(shè)計[26]的實驗條件及實驗結(jié)果見表2。對表2中實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到回歸方程為：Y=5.35+0.15X1+ 0.16X2+0.23X3-0.05X1X2-0.077X1X3-0.16X2X3-0.66X12-0.43X22-0.41X32。再對該模型進行響應(yīng)面分析，得出二次響應(yīng)回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。

表2 RSM實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and corresponding results for RSM

由表3的ANOVA方差分析可知，模型的p值＜0.01，差異極顯著，說明回歸模型擬合程度較好，實驗誤差小，可以用該模型對乙醇微波超聲雙輔助提取金銀花綠原酸的提取率進行分析和預(yù)測。從F值可知，各因素對金銀花綠原酸提取率的影響順序為：X3＞X2＞X1，即液料比＞微波時間＞微波功率；一次項X1、X2和X3極顯著，二次項X12、X22和X32極顯著，交互項X2X3顯著，X1X3、X1X2不顯著，說明二次項響應(yīng)值對實驗結(jié)果影響很大，不是簡單的一次線性關(guān)系。

對表3的分析結(jié)果作回歸優(yōu)化響應(yīng)曲面，見圖8。

表3 二次響應(yīng)模型方差分析Table 3 ANOVA results of the fitted quadratic regression model

圖8 X1X2、X1X3和X2X3分別對綠原酸提取率影響的響應(yīng)面Fig.8 The response surface of X1X2，X1X3and X2X3on extraction yield of chlorogenic acid

由圖8可知，響應(yīng)面都是開口朝下的拋物曲面，其中心位于實驗考察的區(qū)域范圍內(nèi)，說明在實驗范圍內(nèi)所考察指標(biāo)存在最大值。

利用Design Expert 7.0軟件進行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合，可得金銀花綠原酸提取的最佳工藝條件為微波功率418.69W、微波時間93.90s、液料比42.52∶1mL/g，在該條件下金銀花綠原酸提取率預(yù)測值為5.40%。

為了檢驗響應(yīng)面法的可靠性，在上述最佳工藝條件進行金銀花中綠原酸微波超聲雙輔助提取的實驗，平行5次，同時考慮實際操作情況，將金銀花綠原酸最佳工藝條件修正為：微波功率400W、微波時間94s、液料比42∶1mL/g，實際得到金銀花綠原酸提取率的平均值為5.45%，與預(yù)測值基本吻合，從而證實該模型可用于金銀花綠原酸的提取。與水煎煮法[11]、乙醇回流法[12]、超聲提取法[10]、微波法[7]相比，微波超聲雙輔助提取金銀花綠原酸的提取率高，提取時間短。

3 結(jié)論

以金銀花為原料，采用微波超聲雙輔助提取綠原酸，通過單因素和Box-Behnken響應(yīng)面法實驗得到優(yōu)化的工藝參數(shù)：微波功率400W、微波時間94s、液料比42∶1mL/g、乙醇濃度70%、超聲溫度為60℃、超聲時間60min，在該條件下驗證金銀花綠原酸提取率的平均值為5.45%。

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Optimization of microwave-ultrasonic-assisted extraction of chlorogenic acid from Flos Lonicerae using response surface methodology

YOU Xiu-li，CHI Lu-hua，CAO Yun-mei，ZHEN Jian-zhong，TAN Chang-hui
（Colllege of Chemistry and Environment，Minnan Normal University，Zhangzhou 363000，China）

The microwave-ultrasonic-assisted extraction of chlorogenic acid from Flos Lonicerae was optimized using response surface methodology.The extraction yield of chlorogenic acid was investigated with respect to six process parameters including ethanol concentration，temperature，ultrasonic treatment time，solvent-to-solid ratio，microwave power and microwave time.As a result，a quadratic polynomial mathematical model was built. The optimal extraction conditions of RSM were determined as follows：Flos Lonicerae were suspended in microwave power of 400W，microwaves 94s，70%ethanol concentration at solvent-to-solid ratio 42∶1mL/g and then subjected to ultrasonic treatment for 60min at temperature of 60℃.Under the modified conditions，the extraction yield of polyphenols was 5.45%.

response surface methodology；microwave-ultrasonic-assisted extraction；Flos Lonicerae；

TS201.1

B

1002-0306（2014）12-0272-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.051

2013－08－05

尤秀麗（1978-），女，碩士研究生，講師，主要從事天然產(chǎn)物的提取、手性識別機理方面的研究。

福建省教育廳科技項目（JA12218）；漳州師范學(xué)院新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃（SX1101）。

chlorogenic acid