王不留行多糖提取工藝研究及其含量測定

李 青，潘再良，吳 潔，*，張海江（1.西南科技大學材料科學與工程學院，四川綿陽621010；2.淮陰工學院生命科學與化學工程學院，江蘇淮安2200；.蘇州杰成醫(yī)療科技有限公司，江蘇蘇州215200）

王不留行多糖提取工藝研究及其含量測定

李 青1，2，潘再良3，吳 潔1，2，*，張海江2，*
（1.西南科技大學材料科學與工程學院，四川綿陽621010；2.淮陰工學院生命科學與化學工程學院，江蘇淮安223003；3.蘇州杰成醫(yī)療科技有限公司，江蘇蘇州215200）

采用水提醇沉提取工藝，運用單因素實驗和正交實驗，以多糖提取率為評價指標，確定王不留行多糖的最佳提取工藝條件。多糖含量測定方法采用酶解-苯酚-硫酸法。結果表明，王不留行多糖最佳工藝條件為提取溫度100℃，提取時間2h，水料比10∶1（mL/g），提取次數(shù)為3次。在此優(yōu)化條件下的多糖提取率為29.32%。王不留行經清炒炮制后，多糖提取率降為22.15%。

王不留行，多糖，提取工藝，酶解，苯酚-硫酸法

王不留行，又名麥藍菜、剪金花、奶米、大麥牛，是石竹科植物麥藍菜（Vaccaria segetalis（Neck.）Garcker）的種子，具有催生下乳的功能，是臨床常用的下乳藥，也是常用的奶牛飼料添加劑[1-3]。已發(fā)現(xiàn)的王不留行主要成分包括黃酮類、生物堿類、三萜皂苷類、環(huán)肽類、類脂等化合物[4-8]，但其活性成分仍未明確。本課題組近年來對王不留行的化學成分及其生物活性開展了較為系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)王不留行中的多糖類成分具有顯著的利尿通淋作用，具有重要的研究價值[9-11]。多糖是構成生命的四大基本物質之一，在動植物體內有著廣泛分布。已有研究表明，多糖具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、降血糖血脂、抗衰老等多種藥理作用[12-14]，在保健食品和醫(yī)藥應用等方面具有很廣的開發(fā)應用價值。本文首次報道了王不留行多糖的提取工藝和含量測定研究，為王不留行多糖的深入研究與開發(fā)提供樣品的制備和分析方法，同時，為進一步拓寬王不留行藥材資源的藥用途徑及開發(fā)系列功能性食品添加劑提供了一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

王不留行 河北安國藥材市場；葡萄糖、無水乙醇、濃H2SO4、苯酚 均為分析純；α-淀粉酶（20000u/g）

食品級。

電子天平 日本島津；HHS2數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；EYELA旋轉蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；Avanti J-26XP高速冷凍離心機 BECKMAN COULTER；FreeZone冷凍干燥機 LABCONCO；T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 王不留行多糖提取工藝流程 10g王不留行→熱水浸提→過濾→濃縮→醇沉12h→離心→冷凍干燥→粗多糖。

根據(jù)實驗設計在相應提取條件（溫度、時間、水料比、次數(shù)）下，采用熱水浸提法提取王不留行多糖，250目濾布過濾，合并提取液，濃縮至100mL左右，加無水乙醇至濃度約75%，醇沉12h，5000r/min離心5min，沉淀經冷凍干燥后研磨，備用。

1.2.2 苯酚-硫酸法測定多糖含量 參照中國藥典[15]和文獻[16-18]報道的苯酚-硫酸法并稍作修改，以葡萄糖為標準品制備標準曲線。精確稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖100mg于100mL容量瓶中，加去離子水至刻度，超聲溶解得1.0mg/mL的標準葡萄糖母液。基于母液配制15、20、25、30、35、40、50μg/mL的系列葡萄糖標準溶液。用移液槍分別吸取上述濃度的葡萄糖標液2.0mL于25mL具塞比色管中，然后加入1.0mL新制的6%苯酚，搖勻，迅速加入5.0mL濃H2SO4，搖勻，室溫顯色30min，以2.0mL去離子水按同樣顯色操作為空白，在490nm波長處測定吸光度。以葡萄糖濃度（X）為橫坐標，以吸光度（Y）為縱坐標繪制標準曲線，擬合回歸方程。

1.2.3 王不留行多糖含量的測定 直接測定：精確稱取25.0mg提取物樣品，加入100mL去離子水，于90℃水浴溶解，配制成適當濃度的待測樣品液，按照

1.2.2 中的苯酚-硫酸法測定吸光值，根據(jù)葡萄糖標準曲線計算提取物中多糖含量。

酶解后測定：精確稱取25.0mg提取物樣品，加入100mL去離子水，再精密加入相當于約10μg淀粉酶的稀釋液，于90℃水浴攪拌酶解至用碘液檢測到無藍色為止。配制適當濃度的待測樣品溶液，按照1.2.2中的苯酚-硫酸法測定吸光值，根據(jù)葡萄糖標準曲線計算提取物中多糖含量。

總提取率（%）=（提取物質量/原料質量）×100

多糖提取率（%）=總提取率（%）×多糖含量（%）

1.2.4 單因素實驗設計 按1.2.1工藝流程提取王不留行多糖，設計單因素實驗考察提取溫度、提取時間、水料比和提取次數(shù)對多糖提取率的影響。

1.2.4.1 提取溫度考察 固定提取時間2h，水料比20mL/g，提取次數(shù)2次；提取溫度設計為85、90、95、100℃。

1.2.4.2 提取時間考察 固定提取溫度100℃，水料比20mL/g，提取次數(shù)2次；提取時間設計為1、2、3、4h。

1.2.4.3 水料比考察 固定提取溫度100℃，提取時間2h，提取次數(shù)2次；水料比設計為5∶1、10∶1、20∶1、30∶1mL/g。

1.2.4.4 提取次數(shù)考察 固定提取溫度100℃，提取時間2h，水料比20mL/g；提取次數(shù)設計為1、2、3、4次。

1.2.5 正交實驗設計 在單因素實驗基礎上，綜合提取成本和效率因素，確定正交實驗工藝參數(shù)范圍，以提取溫度、提取時間、水料比和提取次數(shù)四個因素設計正交實驗，每個因素設定3個水平，選用L9（34）正交表，以多糖提取率為評價指標，優(yōu)化出多糖提取的最優(yōu)條件。正交實驗因素水平設計見表1。

表1 正交實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental

1.2.6 炮制后王不留行多糖提取 按藥典方法[15]，取三批王不留行，每批200g置鐵鍋內，用電磁爐于中火（1200W）加熱，邊炒邊攪拌，至大部分（85%）王不留行爆開白花，停止加熱。取出，放涼，稱重。

在正交實驗優(yōu)化所得到的最佳提取工藝條件下，準確稱取10g炮制后的王不留行，按照1.2.1工藝流程提取王不留行多糖。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的建立

苯酚-硫酸法測定葡萄糖標準曲線見圖1。以吸光度（Y）對葡萄糖濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程：Y=0.0159X－0.009，R2=0.9984。實驗表明，在15～ 50μg/mL范圍內，葡萄糖濃度與吸光度之間呈現(xiàn)良好的線性關系。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 不同方法測定多糖含量的比較

多糖含量測定過程中發(fā)現(xiàn)，王不留行多糖的水溶性較差，加熱后仍有較多不溶物。碘液實驗顯示提取液呈陽性反應，表明提取物中的多糖存在α-1，4和α-1，6葡萄糖苷鍵。基于此，實驗首先采用淀粉酶對提取物進行酶解，以期將不溶性多糖降解后提高水溶性以有效測定其多糖含量。對提取物樣品分別采用直接測定和酶解后測定多糖含量，結果見表2。

酶解后的多糖水溶性明顯提高，測得的多糖含量較酶解前有明顯提高，論證了實驗設想。因此，本研究工作中均采用酶解-苯酚-硫酸法作為多糖含量測定方法。同時，這一結果初步顯示α-1，4和α-1，6葡萄糖苷鍵是王不留行多糖中的重要糖苷鍵型。

表2 酶解前后多糖含量對比（n=3）Table 2 Contrast of polysaccharide content before and after enzymatic degradation（n=3）

2.3 單因素實驗結果分析

2.3.1 提取溫度對王不留行多糖提取率的影響 由圖2可看出，多糖提取率隨溫度的升高而增加，表明溫度的升高有利于提高多糖分子的傳質速率，同時也增加了多糖在水中的溶解度。提取溫度為85～95℃時，王不留行破壁緩慢，且破壁率較低，多糖提取率隨著提取溫度有緩慢增加。當溫度達到100℃時，水沸騰，王不留行迅速破壁，大大加速了多糖溶出，使得多糖提取率從7.51%猛增至24.77%。

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.2 Influence of extraction temperature on yield of polysaccharide

2.3.2 提取時間對王不留行多糖提取率的影響 由圖3可看出，多糖提取率隨提取時間的增加呈上升趨勢，當達到3h后多糖提取率變小。這是由于隨著時間的延長，多糖不斷被浸提出來，提取3h后，多糖提取率趨于平緩。

圖3 提取時間對多糖提取率的影響Fig.3 Influence of extraction time on yield of polysaccharide

2.3.3 水料比對王不留行多糖提取率的影響 由圖4可看出，多糖提取率隨水料比的增加呈上升趨勢，根據(jù)固液擴散原理，溶劑量的增加有利于多糖分子的轉移及擴散，從而使多糖提取率提高。在10～30mL·g-1水料比范圍內，溶劑用量對王不留行多糖提取率影響不大。

圖4 水料比對多糖提取率的影響Fig.4 Influence of water-material ratio on yield of polysaccharide

2.3.4 提取次數(shù)對王不留行多糖提取率的影響 由圖5可看出，多糖提取率隨提取次數(shù)的增加呈上升趨勢。當提取3次后，多糖提取率的增加趨于平緩。考慮到時效、能耗等成本因素，設計正交實驗的提取次數(shù)最多為3次。

圖5 提取次數(shù)對多糖提取率的影響Fig.5 Influence of times of extraction on yield of polysaccharide

2.4 正交實驗結果分析

正交實驗結果見表3，方差分析見表4。由方差分析結果可知，熱水浸提法各因素對王不留行多糖提取率沒有顯著影響，對其影響的主次順序與極差分析一致，即A＞D＞B＞C。其中，提取溫度對王不留行多糖提取率影響最大，其次是提取次數(shù)、提取時間，水料比的影響最小。分析結果表明，王不留行多糖最優(yōu)提取工藝條件為A3B2C1D3，即提取溫度100℃，提取時間2h，水料比10∶1（mL·g-1），提取3次，恰為正交試驗的第8組，此時王不留行多糖提取率為29.32%，提取物中的多糖含量為93.27%。

2.5 王不留行炮制前后對比

王不留行多以清炒炮制后入藥，王不留行炮制得率約為86.3%（n=3），即10g王不留行經清炒后得到8.63g炮制品。本文按正交實驗優(yōu)化得到的最佳條件對炮制前后的王不留行分別進行多糖提取，結果見表5。從表5中可以看出，王不留行經炮制后，總提取率和多糖提取率均明顯降低，而總提取物中的多糖含量相近。表明在炮制過程中，王不留行中的多糖發(fā)生了較大程度的分解。這為進一步開展王不留行的炮制作用及其機理研究提供了重要的線索。

表3 正交實驗結果Table 3 Results of Orthogonal experiment

表4 方差分析結果Table 4 Results of ANOVA

表5 炮制前后的王不留行多糖提取結果（n=3）Table 5 Results of polysaccharides extraction from Semen vaccaria and fried Semen vaccaria（n=3）

3 結論

本論文首次對王不留行中多糖成分的提取制備工藝與含量測定開展研究。采用水提醇沉法進行提取，酶解-苯酚-硫酸法測定多糖含量，優(yōu)化得到最佳工藝條件：提取溫度100℃，提取時間2h，水料比10∶1（mL·g-1），提取3次，其中提取溫度對多糖提取率的影響最大。最優(yōu)提取工藝下的總提取率和多糖提取率分別為31.44%和29.32%。王不留行經清炒炮制后，總提取率和多糖提取率均明顯降低，分別為23.16%和22.15%。研究結果為王不留行多糖的制備和分析提供了可靠的方法學支持，為進一步研究與開發(fā)王不留行多糖打下了良好的科學基礎。

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Study on extraction process and content determination of polysaccharides from Semen vaccaria

LI Qing1，2，PAN Zai-liang3，WU Jie1，2，*，ZHANG Hai-jiang2，*
（1.School of Materials Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China；2.School of Life Science and Chemical Engineering，Huanyin Institute of Technology，Huaian 223003，China；3.Suzhou Jiecheng Medical Technology Co.，Ltd.，Suzhou 215200，China）

The extraction of bioactive polysaccharide in Semen vaccaria was studied in this paper.The water extract and alcohol precipitate method was used for the extraction of polysaccharides and was optimized by single factor and orthogonal experiments.The polysaccharide content was determined by phenol-sulfuric acid method after enzymatic degradation.The optimum extraction condition was obtained as follows：100℃，extract for three times with 2 hours and water-material ratio of 10∶1（mL/g）for each time.Under the optimal conditions，the polysaccharide yield was 29.32%.The polysaccharide yield for the fried Semen vaccaria was 22.15%.

Semen vaccaria；polysaccharide；extraction technology；enzymatic degradation；phenol-sulfuric acid method

TS201.2

A

1002-0306（2014）12-0299-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.057

2013－09－02 *通訊聯(lián)系人

李青（1987-），女，碩士研究生，研究方向：分析化學。

江蘇省教育廳高校科研成果產業(yè)化推進項目（JHB2012-57）；淮安市“533英才工程”資助項目（141）；江蘇省高等學校大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃項目（12040）。