交替假單胞菌產幾丁質酶的響應面優化

王曉輝，岳 敏（1.大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連116622；2.中國科學院大連化學物理研究所，遼寧大連116023；3.中國科學院大學，北京100049）

交替假單胞菌產幾丁質酶的響應面優化

王曉輝1，2，3，岳 敏2，3
（1.大連大學生命科學與技術學院，遼寧大連116622；2.中國科學院大連化學物理研究所，遼寧大連116023；3.中國科學院大學，北京100049）

采用響應面法對交替假單胞菌發酵產幾丁質酶的培養基進行了優化。首先利用Plackett Burman實驗設計篩選出影響產酶的3個主要因素，即膠體幾丁質、發酵溫度和pH。在此基礎上用最陡爬坡路徑逼近最大響應區域，再利用Box-Behnken實驗設計及響應面分析法確定最佳條件。結果表明，膠體幾丁質8.95g/L，蛋白胨2g/L，轉速130r/min，接種量2%，發酵溫度20℃，pH6.18，發酵時間96h，幾丁質酶最大理論酶活為57.95U/mL。經3次實驗驗證，實際平均酶活與預測酶活相近，比優化前幾丁質酶酶活提高了23.77%。

交替假單胞菌，幾丁質酶，發酵，響應面分析

幾丁質（chitin），俗稱甲殼素、甲殼質，由N-乙酰葡萄糖胺單體以β-1，4-糖苷鍵連接起來的直鏈多聚物，是自然界中含量最豐富，海洋環境中僅次于纖維素的第二大可再生資源。幾丁質廣泛存在于甲殼綱動物蝦蟹、昆蟲的甲殼，以及真菌（酵母，霉菌）、藻類、植物的細胞壁中[1]。據估測，海洋環境每年超過1011噸幾丁質形成，其降解主要是通過產幾丁質酶的微生物完成[2-3]。

幾丁質酶（Chitinase，EC3.2.1.14）是專一降解幾丁質為幾丁寡糖或幾丁單糖的一組酶的總稱[3]。根據幾丁質酶氨基酸序列的同源性，將其分為18和19兩個家族。其中，18家族幾丁質酶廣泛存在于病毒、微生物、植物和動物中，而19家族幾丁質酶主要存在于植物中。另外，在鏈霉菌屬和一些擬諾卡氏菌屬的放線菌中也發現了19家族幾丁質酶[4-5]，18家族和19家族幾丁質酶之間沒有序列相似性，說明它們由不同祖先進化而來[6]。

微生物幾丁質降解系統主要由內切幾丁質酶（chitinase，EC 3.2.1.14）、外切幾丁質酶（chitinase，EC 3.2.1.14）和β-N-乙酰己糖胺酶（β-N-acetylhexosaminidase，EC 3.2.1.52）組成。內切幾丁質酶在高聚幾丁質鏈內隨機切割生成幾丁質寡糖（chitooligosaccharides，（GlcNAc）n，n＞2）；外切幾丁質酶有兩種，分別從高聚幾丁質鏈的還原端和非還原端依次切割下（GlcNAc）2；β-N-乙酰己糖胺酶將從非還原端將幾丁質寡糖切割成為GlcNAc。某些物種中還發現了幾丁質結合蛋白，起到分散幾丁質糖鏈束的作用[7-8]。幾丁質酶降解幾丁質產生的幾丁寡糖、幾丁單糖及其衍生物由于具有良好的組織兼容性和生物降解性以及調節免疫力和抗癌的保健功能等特點，在醫藥、食品、農業、工業等領域有著廣泛的應用前景[9-10]。

交替假單胞菌（Pseudoalteromonas）是海洋環境產幾丁質酶的典型微生物，據報道該屬可產生7種不同類型幾丁質酶，該幾丁質降解系統包括4種幾丁質酶，3種N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，1種糖基轉移酶，1種幾丁質結合蛋白和1種幾丁質結合蛋白酶，協同降解幾丁質，應用潛力巨大[11-13]。但國外已報道的交替假單胞菌野生菌生產幾丁質酶的產量都比較低，國內未見該菌屬生產幾丁質酶的相關報道。本文從海洋底泥樣品中篩選到高產幾丁質酶的交替假單胞菌，命名為PseudoalteromonasDL-6（CGMCC NO.8580），擬通過響應面優化策略，進一步提高其幾丁質酶產量，為后期幾丁質酶的分離純化、底物特異性與寡糖生產等酶學性質及應用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

交替假單胞菌（Pseudoalteromonas sp.DL-6） 篩選自中國遼寧大連渤海海域近海底泥6～100m（123° 371′E，39°6972′N）；活化培養基（1000mL） 膠體幾丁質10.0g，胰蛋白胨5.0g，瓊脂粉15.0g，原地海水配制，pH自然；2216E斜面保藏培養基（1000mL）[14]牛肉膏1.0g，蛋白胨5g，瓊脂粉15g，原地海水配制，pH自然；種子培養基（1000mL） 牛肉膏1.0g，蛋白胨5g，原地海水配制，pH自然；發酵培養基（1000mL） 膠體幾丁質5g，蛋白胨5g，原地海水配制，pH自然；幾丁質粉 美國Sigma公司；其他試劑 均為國產分析純。

LRH系列生活培養箱、HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；全溫振蕩培養箱 太倉市華美生化儀器廠；Thermo Multiskan Ascent型酶標儀 芬蘭Labsystems公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠體幾丁質的制備[14]稱取10.0g幾丁質粉加100mL濃鹽酸，攪拌均勻，加去離子水1.0L，反復洗至中性，最后用PBS（pH7.0）緩沖液重溶，配制成1%膠體幾丁質溶液，避光保存于冰箱備用。

1.2.2 粗酶液制備 于2216E斜面保藏培養基挑取1環種子到液體種子培養基，20℃，130r/min搖床培養24h后，接種1%至發酵培養基，發酵培養4d，5000r/min下離心10min，收集上清液為粗酶液測酶活。

1.2.3 酶活檢測 取粗酶液0.1mL與0.9mL，1%膠體幾丁質混合，20℃下保溫30min后，將反應混合物加熱在沸水浴中10min終止酶反應，10，000×g離心5min，取上清0.5mL，加入1mL Schales試劑[15]，沸水浴10min，測定OD420nm，設3個重復，取平均值，跟據N-乙酰-D-氨基葡萄糖標準曲線計算酶活力。酶活單位定義（U）：在上述條件下，1min催化產生相當于lμmol的N-乙酰-D-氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量。

1.2.4 實驗設計

1.2.4.1 Plackett-Burman設計法篩選幾丁質酶酶活的顯著因素 根據前期優化單因素實驗結果，分析可能影響Pseudoalteromonassp.DL-6發酵產幾丁質酶的眾多因素包括：氮源、碳源、轉速、接種量、發酵溫度、pH、培養時間。用PB設計對以上7個因素進行全面考察，以軟件Minitab設計N=12的7因素，2水平的Placket-Burman實驗。并設計4項虛擬項（A、E、F、H）。各因素對應因子代碼如表1所示。

表1 Plackett-Burman實驗設計各因素水平及分析Table 1 Levels of the variables and statistical analysis of Plackett-Burman design

1.2.4.2 最陡爬坡實驗 根據Plackett-Burman的實驗結果，做最陡爬坡實驗，最陡爬坡法以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長，能快速、經濟地逼近最佳值區域。確定Box-Behnken的中心點。

1.2.4.3 Box-Behnken實驗設計 根據Plackett-Burman實驗得到的三個顯著因素及最陡爬坡實驗的確定的中心點，設計N=15的3因素3水平實驗。以膠體幾丁質X1、溫度X2、pH X3為自變量設計N=15組的Box-Behnken實驗。如表2所示。

表2 響應面因素設計水平表Table 2 Range of different factor invested in RSM

1.3 數據分析

Plackett-Burman設計法是一種多因素、兩水平的實驗設計方法，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素，供進一步研究用[16]。最陡爬坡實驗用以確定Box-Behnken實驗的中心點，使B-B實驗因素所取水平能最大程度的逼近最佳值區域。Box-Behnken設計用以確定因素對響應值的二次方程，從而計算出在選定范圍內各因素的最佳值[17-19]。本文采用Minitab軟件對實驗數據進行分析，所做實驗結果均有3組重復。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基的P-B（Plackett-Burman）設計

由表1和Minitab軟件得到PB實驗設計，每組配方做三個平行樣，N=12的PB實驗設計及3次酶活的平均值結果如表3所示。

表3 Plackett-Burman設計結果Table 3 Plackett-Burman design matrix for evaluating factors influencing

表4 P-B實驗設計各因素主效應分析結果Table 4 Results of the variables and effect in P-B design

通過軟件對實驗數據進行分析，獲得多元一次回歸方程：

R1=52.04+0.33B+0.46C+1.39D-0.17G+0.079J+ 0.60K+0.83L

式中，R1為酶活的預測值；B、C、D、G、J、K、L分別為時間、蛋白胨、膠體幾丁質、接種量、轉速、溫度、pH的編碼水平。

根據實驗結果，該模型顯著（p=0.0160＜0.05）。從表4可以看出，膠體幾丁質（D），pH（L），發酵溫度（K）的p值（Prob＞F）小于0.05，說明這三個因素是主要響應因素，后續采用響應面分析法對這三個因素進行進一步研究。

其他因素對響應值影響均不顯著，正效應的因素選取較高值（發酵時間96h、蛋白胨2g/L、轉速為130r/min），負效應的因素選取較低值（接種量2%）進行后續實驗。

2.2 最陡爬坡實驗

根據Plackett-Burman實驗得出：膠體幾丁質，發酵溫度和pH為影響發酵顯著的三個因素，根據P-B實驗結果設計最陡爬坡實驗如表5所示。膠體幾丁質、溫度和pH均為顯著正效應。得到最佳因子組為第2組：膠體幾丁質8g/L，pH7.0，發酵溫度15℃，以最佳因子組作B-B實驗的中心點。

表5 最陡爬坡實驗設計及實驗結果Table 5 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 響應面實驗優化培養條件

2.3.1 B-B（Box-Behnken）實驗設計 由Plackett-Burman實驗和最陡爬坡實驗確定的3個顯著性因素和3個水平。以膠體幾丁質X1、溫度X2、pH X3為自變量設計N=15組的Box-Behnken實驗。每組實驗進行3次重復，結果取3次實驗的平均值，結果如表6所示。

表6 Box-Behnken設計結果Table 6 Box-Behnken design with three independent variables

2.3.2 多元二次回歸方程的建立及顯著性檢驗 根據Minitab軟件對實驗結果分析得二次回歸方程：

Y=56.05+1.921X1+0.516X2+0.398X3-2.211X12-0.821X22-1.669X32+1.333X1X2-1.200X1X3-1.930X2X3。

對方程進行回歸系數顯著性檢測和方差分析，見表7。

根據響應面方差分析結果，模型失擬項p=0.2009，影響不顯著，模型顯著（p=0.0007），說明模型選擇比較合適。回歸系數R2=98.25%大于90%，說明模型相關度很好。因此認為可用來代替真實實驗點對實驗結果進行分析和預測。由表7回歸系數的顯著性檢驗可知，因素X1、X2對產酶的線性效應均顯著，X3對產酶的線性效應不顯著。

表7 回歸方差系數表Table 7 Coefficient of regression equation

2.3.3 響應面分析及最優培養基成分和培養條件的確定 在獲得回歸非線性模型之后，為了求得各因子最佳值，根據所得到的回歸模擬方程分別對各變量求一階偏導數，并令其為零，得到一個三元一次方程組，求解此方程組可得到模型的極值，即當膠體幾丁質8.95g/L、發酵溫度20℃、pH6.18時，96h理論最大幾丁質酶酶活為57.925U/mL。

圖1 溫度與膠體幾丁質交互影響酶活的響應曲面圖Fig.1 Response surface plot of the effects of temperature and chitin colloidal chitin on the enzyme activity

圖2 pH與膠體幾丁質交互影響酶活的響應曲面圖Fig.2 Response surface plot of the effects of pH and colloidal chitin on the enzyme activity

根據二次多項式模型利用Minitab軟件繪出響應面分析圖，見圖1～圖3。每個響應面分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用，此時第三個變量的編碼值為零。由響應面圖可以看出：膠體幾丁質、發酵溫度、pH三個因素之間存在著明顯的交互作用，在實驗水平范圍內，隨著膠體幾丁質、發酵溫度、pH的量增加，幾丁質酶酶活呈先增加后降低的趨勢。當膠體幾丁質、發酵溫度、pH分別為8.95g/L，20℃，6.18時達到最佳，幾丁質酶酶活的理論值為57.925U/mL。

圖3 pH和溫度交互影響酶活的響應曲面圖Fig.3 Response surface plot of the effects of pH and temperature on the enzyme activity

為了驗證模型的準確性，同時考慮到實際操作的可能性，將最佳發酵條件的參數進行取整，即膠體幾丁質9.0g/L、蛋白胨2g/L、轉速為130r/min、接種量2%、發酵溫度20℃、pH6.0、發酵時間96h，進行3次搖瓶發酵實驗，所得幾丁質酶的平均酶活為57.95U/mL。優化前各參數分別為：膠體幾丁質10.0g/L、蛋白胨5g/L、轉速為160r/min、接種量2%、發酵溫度15℃、pH自然、發酵時間48h，酶活為46.82U/mL，相比優化前采用響應面優化后酶活為57.95U/mL，提高了23.77%。可見該模型能夠較好地預測實際發酵情況。

3 結論

在交替假單胞菌產幾丁質酶搖瓶發酵過程中，膠體幾丁質、發酵溫度和pH是重要因素。根據Box-Behnken設計原理，經過響應面優化的培養條件為膠體幾丁質8.95g/L，發酵溫度20℃，pH6.18。根據響應面結果最大酶活并結合實驗的實際情況，確定最優發酵條件為：膠體幾丁質9.0g/L、蛋白胨2g/L、轉速為130r/min、接種量2%、發酵溫度20℃、pH6.0、發酵時間96h。在該優化發酵條件下，酶活力達57.95U/mL，較初始發酵條件（酶活46.82U/mL）提高了23.77%。

[1]Souza CP，Almeida BC，Colwell RR，et al.The importance of chitin in the marine environment[J].Mar Biotechnol，2011，13（5）：823-830.

[2]AL Svitil，S Chadhain，JA Moore，et al.Chitin Degradation Proteins Produced by the Marine Bacterium Vibrio harveyi GrowingonDifferentFormsofChitin[J].Applied and Environmental Microbiology，1997，63（2）：408-413.

[3]王海東，陳飚，倫鏡盛，等.產幾丁質酶菌株SWCH-6的篩選、鑒定及其產酶條件的優化研究[J].微生物學通報，2008，35（5）：705-711.

[4]Bhattacharya D，A Nagpure，RK Gupta.Bacterial Chitinases：Properties and Potential[J].Critical Reviews in Biotechnology，2007，27（1）：21-28.

[5]T Ohno，S Armand，T Hata，et al.A modular family 19 chitinase found in the prokaryotic organism Streptomyces griseus HUT 6037[J].Journal of Bacteriology，1996，178（17）：5065-5070.

[6]肖湘，周櫻，王鳳平，等.高效幾丁質降解茵CBl01的分離鑒定及其幾丁質酶系的研究[J].海洋學報，2003，25（1）：138-142.

[7]McCreath KJ，Gooday GW.A rapid and sensitive microassay for determination of chitinolytic activity[J].J Microbiol Methods，1992（14）：229-237.

[8]Horn SJ，Sikorski P，Cederkvist JB，et al.Costs and benefits of processivity in enzymatic degradation of recalcitrant polysaccharides[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（48）：18089-18094.

[9]Vincent GH Eijsink，Gustav Vaaje-Kolstad，Kjell M V?rum，et al.Towards new enzymes for biofuels：lessons from chitinase research[J].Trends Biotechnol，2008，26（5）：228-235.

[10]Tsujibo H，Orikoshi H，Shiotani K，et al.Characterization of chitinase C from a marine bacterium，Alteromonas sp.strain O-7，and its corresponding gene and domain structure[J].Appl Environ Microbiol，1998，64（2）：472-478.

[11]Hideyuki Orikoshi，Nao Baba，Shigenari Nakayama，et al. Molecular analysis of the gene encoding a novel cold-adapted chitinase（ChiB）from a marine bacterium，Alteromonas sp.strain O-7[J].J Bacteriol，2003，185（4）：1153-1160.

[12]HideyukiOrikoshi，ShigenariNakayama， Katsushiro Miyamoto，et al.Roles of four chitinases（chia，chib，chic，and chid）in the chitin degradation system of marine bacterium Alteromonas sp.strain O-7[J].Appl Environ Microbiol，2005，71（4）：1811-1185.

[13]Xie B B，Shu YL，Qin QL.Genome Sequences of Type Strains of Seven Species of the Marine Bacterium Pseudoalteromonas[J]. Journal of Bacteriology，2012，194（10）：2746-2747.

[14]SC Hsu，JK Lockwood.Powdered chitin agar as a selective medium for enumeration of actinomycetes in water and soil[J]. Appl Microbiol，1975，29（3）：422-466.

[15]Imoto T，Yagisshita K.A simple activity measurement of lysozyme[J].Agric Biol Chem，1971，35（7）：1154-1156.

[16]Miller A，Sittter RR.Using the folded-over 12-run plackettburman design to consider interactions[J].Technometrics，2001（3）：44-54.

[17]Ambat P，Ayyanna C.Optimizing medium constituents and fermentation conditionsforcitric production from palmyra jaggery using response surface methods[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2001（17）：331-335.

[18]Ratnam BVV，Narasimha RM，Dmodar RM，et al.Optimization of fermentation conditions for the production of ethanol fromsago starch using response surface methodology[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2003，19（5）：523-526.

[19]孟彥羽，岳敏，張建平，等.海南土地桿菌Pedobacter hainanensis 13-Q發酵生產κ-卡拉膠酶的條件優化[J].中國釀造，2013（7）：20-23.

Optimization of fermentation conditions for chitinase production by the Pseudoalteromonas sp.DL-6 using the response surface methodology

WANG Xiao-hui1，2，3，YUE Min2，3
（1.School of Life Science and Biotechnology，Dalian University，Dalian 116622，China；2.Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian 116023，China；3.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

Response surface methodology was used to optimize the fermentation conditions of chitinase by Pseudoalteromonas sp.DL-6.Firstly，the important factors influencing chitinase production were identified by the method of Plackett-Burman as colloidal chitin，fermentation temperature，and pH.The path of steepest ascent was applied to approach the optimal region of the three significant factors.Box-Behnken design and response surface analysis were used to further investigate the optimal central levels and relationships of these factors.By using the quadratic regression model equation and analyzing the response surface of chitinase production，the optimal fermentation conditions were determined as followed：colloidal chitin 8.95g/L，peptone 2g/L，shaking speed 130r/min，inoculums dose 2%，fermentation temperature 20℃，and pH 6.18，respectively. Under these conditons，the maximumtheoretic activity of chitinase was 57.95U/mL.After three verifications，the maximum theoretic value was consistent with mean value of verification test and the chitinase production was increased by 23.77%comparing to that before optimization.

Pseudoalteromonas；chitinase；fermentation；response surface analysis

TS201.3

B

1002-0306（2014）12-0312-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.060

2014－02－20

王曉輝（1981-），女，在職博士，講師，研究方向：微生物與酶工程。

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2007AA021306）。