枳椇子、桑椹、青果復方組合物對小鼠肝臟的保護作用

唐暉慧，金美東（1.黃山學院旅游學院，安徽黃山245021；2.揚州大學旅游烹飪學院，江蘇揚州225009；.黃山學院教育科學學院，安徽黃山245021）

枳椇子、桑椹、青果復方組合物對小鼠肝臟的保護作用

唐暉慧1，2，金美東3
（1.黃山學院旅游學院，安徽黃山245021；2.揚州大學旅游烹飪學院，江蘇揚州225009；3.黃山學院教育科學學院，安徽黃山245021）

為研究枳椇子、桑椹、青果的水提物（質量比例為2.2∶3.8∶2.8）組成的復方組合物的保肝作用，以此復方組合物灌胃小鼠30d，對小鼠灌胃白酒，再測定肝臟組織中谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、甘油三酯（TG）含量和乙醇脫氫酶（ADH）活性來評價復方組合物的保肝效果。結果顯示，復方組合物的高、中、低劑量組可顯著提高小鼠肝臟GSH含量（p＜0.01）和降低MDA含量（p＜0.01），而只有高、中劑量組可極顯著降低TG含量（p＜0.01），高、中、低劑量組可顯著激活ADH活性（p＜0.01），發(fā)揮出色的保肝護肝作用。本研究為復方組合物的保肝作用提供數據支撐。復方中三種植物都是藥食同源植物，說明此復方可開發(fā)為保肝類保健食品。

保肝，桑椹，青果，枳椇子，組合物

酒精的代謝和分解多在肝臟中完成，因此大量飲酒會給肝臟帶來很大負擔。同時在酒精代謝過程中會產生許多代謝產物，如乙醛、自由基離子等。這些代謝產物的對機體的傷害都大于酒精本身，會引發(fā)炎癥，造成肝細胞損傷，降低免疫功能，導致死亡[1]。機體大量攝入乙醇后，主要在乙醇脫氫酶（ADH）的催化下氧化為乙醛，并被乙醛脫氫酶氧化為乙酸鹽類物質。因此認為ADH是乙醇代謝過程中的一種重要酶類，保持其活性能夠加速體內乙醇的分解代謝，降低體內乙醇的蓄積[2]。乙醇大量氧化使得三羧酸循環(huán)障礙和脂肪酸氧化減弱而影響脂肪代謝，致使脂肪在肝細胞內沉積[3]。同時乙醇能激活氧分子，產生氧自由基導致肝細胞膜的脂質過氧化及體內還原型谷胱甘肽（GSH）消耗、丙二醛（MDA）升高，甘油三酯（TG）的代謝也會受到明顯影響[4-5]。

酒精代謝過程中一系列代謝產物引起細胞和組織的氧化損傷，因此對酒精性肝損傷的研究廣受關注[6]。近些年，在酒精性肝病的發(fā)病機制方面的研究取得了很大的進步，但是目前除了自覺限制飲酒量以外，藥物對于該類損傷的治療效果并不明顯[7]。因此，研究天然藥物對酒精性肝損傷的保護作用迫在眉睫。在前期工作中，本團隊從古今重要解酒方中挑選出20余種藥食同源植物作為研究對象，并從中篩選解酒功效最佳的天然提取物，經過優(yōu)化發(fā)現(xiàn)枳椇子、青果和桑椹的水提物組成的復方具有較好的乙醇保持率和抗氧化活性[8]，但是此復方的保肝作用缺乏動物實驗數據支撐。此外，復方中三種原料的解酒保肝效果已有報道，而三者配制組成復方還未見報道。本文通過灌胃小鼠復方組合物后，再經過灌胃白酒造成小鼠肝臟指標異常，測定不同組別小鼠的肝臟組織中GSH、MDA和TG的含量以及ADH酶活性來評價復方組合物的保肝作用，為以此復方開發(fā)解酒保肝類保健食品提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ICR雌性小白鼠 體重（25±5）g，上海斯萊克實驗動物責任有限公司；青果（Canarium album）、枳椇子（Hovenia duleis）、桑椹（Morus alba） 均購自黃山市華氏大藥房；考馬斯亮藍G-250、甘油三脂試劑盒、丙二醛測試盒、谷胱甘肽過氧化物試劑盒、乙醇脫氫酶測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；海王金樽 廣東深圳海王藥業(yè)有限公司；56°紅星二鍋頭白酒 北京紅星釀酒廠。

Alpha-D2凍干機 德國Christ公司；電子天平 上海天平儀器廠；UV752N紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復方組合物制備 分別取生藥各1kg，各加入5L水，分別煎煮3次，每次1.5h，合并濾液，經負壓（壓強為10kPa，溫度為30℃）蒸發(fā)濃縮5h，再抽濾，再減壓（壓強為10kPa，溫度為40℃）濃縮至稠狀，真空冷凍（壓強為50Pa，溫度為-55℃）干燥24h，經過研磨粉碎得到粗提物粉末。枳椇子、桑椹、青果三種提取物復方配制質量比例為2.2∶3.8∶2.8，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩４藦头降呐渲票壤歉鶕狙芯繄F隊前期配方優(yōu)化研究確定，已申請專利[8]。

1.2.2 動物分組 將72只ICR小鼠在（22±1）℃，濕度40%～60%，12h日夜交替，自由進食、進水的條件下適應性喂養(yǎng)一周后，隨機分為六組。空白對照組（A組）12只：實驗過程中不做任何處理，自由喂養(yǎng)；模型組（B組）12只：0.9%的生理鹽水；低劑量組（C組）12只：濃度為50mg/mL受試配方樣品；中劑量組（D組）12只：濃度為100mg/mL受試配方樣品；高劑量組（E組）12只：濃度為150mg/mL受試配方樣品；陽性對照組（F組）12只：濃度為25mg/mL的海王金樽溶液。

1.2.3 給藥 每日經口灌胃給予20mL/kg·BW受試樣品。空白對照組不做任何灌胃，自由進食、進水；模型對照組按體重給予生理鹽水，連續(xù)給藥30d。每周稱重一次，根據體重調整用藥量。給予受試樣品結束時，將模型對照組及各樣品組一次灌胃給予白酒15mL/kg·BW，空白對照組給蒸餾水[9]。

1.2.4 肝臟樣品制備 末次給藥后，禁食不禁水12h，將小鼠頸椎脫臼處死，解剖取出完整肝臟，預冷生理鹽水清洗至洗液無血色后，吸干肝臟表面水分。剪取0.1g肝臟組織置于小燒杯中（于冰水），準備9倍（0.9mL）于肝臟組織重量的0.9%的生理鹽水，轉移總量2/3的生理鹽水于燒杯中，盡快剪碎組織塊，倒入玻璃勻漿器，再將剩余的1/3生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管進行勻漿，充分研磨后制成10%的組織勻漿，于離心機中以2000r/min離心15min，取上清液備用。

1.2.5 檢測指標 小鼠體重：每周稱量一次小鼠體重，直到實驗結束，以考察受試樣品對各組小鼠體重的影響。肝組織指標測定：各組肝組織中GSH、MDA和TG含量，ADH活性測定根據各試劑盒說明書操作步驟進行。

1.3 數據統(tǒng)計

數據均以（平均值±標準偏差）表示，組間差異采用SPSS 16.0進行單因素分析（ANOVA），以p＜0.05或p＜0.01確定差異是否有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 復方組合物對小鼠體重的影響

從表1可知，從實驗開始到結束，各劑量組與模型組、空白組相比平均體重無顯著差異（p＞0.05），在整個實驗過程中，各組小鼠的體重都是持續(xù)健康正常地增長，各組小鼠也未因灌喂樣品的原因而出現(xiàn)發(fā)育不良、體重減輕，說明本研究所選取的原料配方和劑量是安全的。

表1 不同組小鼠體重變化Table 1 Weights of different groups mice

2.2 復方組合物對谷胱甘肽含量的影響

肝臟谷胱甘肽（GSH）的總含量是評價藥物醒酒保肝功能的一個重要指標。由表2可知，與空白組比較，模型組小鼠經白酒灌胃后，肝臟GSH含量極顯著降低（p＜0.01），說明該模型造模成功。陽性對照組和復方組合物低、中、高劑量組小鼠肝勻漿中GSH含量與模型組相比極顯著升高（p＜0.01），并且在一定范圍內存在劑量的相關性。

已有文獻報道，枳椇子乙醇提取物和水提物，及其與葛花提取物配伍后都未表現(xiàn)出提高醉酒大鼠肝臟GSH的作用，而其乙酸乙酯提取物高劑量組可顯著提高醉酒小鼠肝臟GSH含量（p＜0.01）[10-11]；金銀花、枳椇子和青果三者的提取物配伍的高劑量組可顯著提高醉酒小鼠血清與肝臟中GSH含量（p＜0.05）[12]；由此可知，枳椇子水提物在維持大鼠肝臟GSH含量時表現(xiàn)并不出眾，青果可能具有維持GSH含量的能力。

本實驗中，各劑量組的小鼠肝臟GSH含量都較模型組有極顯著提高（p＜0.01），高劑量組甚至比模型組高42.4%，優(yōu)于已有報道中枳椇子提取物和金銀花、枳椇子、青果提取物配伍的效果，更是接近灌胃海王金樽的陽性對照組，說明復方組合物能夠維持肝臟GSH含量，對抗乙醇損傷引起的肝臟GSH耗竭，提高機體清除自由基的能力，從而對小鼠肝臟起到保護作用。

表2 受試樣品對小鼠肝組織中GSH含量的影響Table 2 Effect of the tested samples on GSH in mice hepatic tissues

2.3 復方組合物對丙二醛含量的影響

由于GSH能在一定程度上阻止肝組織中脂質過氧化反應，而丙二醛（MDA）是脂質過氧化反應的產物之一，因此GSH濃度的降低會間接導致肝臟MDA含量的增加[4]。由表3可知，與空白組比較，模型組小鼠灌胃后，肝臟MDA含量極顯著升高（p＜0.01），說明該模型造模成功。陽性對照組和低、中、高劑量組小鼠肝勻漿中MDA含量與模型組相比顯著下降（p＜0.01），并且在一定范圍內存在劑量的相關性。

已有文獻報道，枳椇子乙酸乙酯提取物、醇提物和水提物可顯著（p＜0.05）降低醉酒大鼠、小鼠肝臟MDA含量[10-11]；桑椹鮮果和果汁可顯著（p＜0.01）降低醉酒大鼠血漿中MDA含量，但對肝臟MDA未表現(xiàn)出降低作用[13]；金銀花、枳椇子和青果提取物配伍高劑量組可顯著（p＜0.05）降低醉酒小鼠血清與肝臟中MDA含量[12]；由此可知，枳椇子、桑椹和青果都可降低醉酒大鼠、小鼠肝臟MDA含量，與模型組相比僅具顯著水平（p＜0.05）。枳椇子醇提物和水提取物雖未表現(xiàn)出維持醉酒小鼠肝臟GSH含量的作用，但表現(xiàn)出降低肝臟MDA含量的作用，說明其可能是通過減少肝臟中脂質過氧化反應來發(fā)揮抗氧化作用。

本實驗中，各劑量組小鼠肝臟MDA含量都較模型組極顯著降低（p＜0.01），但是仍顯著（p＜0.01）高于空白組，說明此復方并不能完全抵抗乙醇引起小鼠肝臟MDA含量升高的影響。此外，復方各劑量組的表現(xiàn)都優(yōu)于前文列述的各種提取物和配伍組方的效果顯著性水平（p＜0.05）。高劑量組中MDA含量較模型組降低達36.8%，接近陽性對照組含量，說明復方組合物能夠減少乙醇引起的肝臟中脂質過氧化，發(fā)揮保護肝臟的作用。

表3 受試樣品對小鼠肝組織中MDA含量的影響Table 3 Effect of the tested samples on MDA in mice hepatic tissues

2.4 復方組合物對甘油三酯含量的影響

當機體攝入大量乙醇時，乙醇在乙醇脫氫酶的作用下大量氧化，使得三羧酸循環(huán)和脂肪代謝受阻，使得甘油三酯（TG）在肝臟中不斷堆積[5]，不但會誘發(fā)較為嚴重的心血管疾病，還會引發(fā)脂肪肝[14]。由表4可知，與空白組比較，模型組小鼠肝臟組織TG含量極顯著升高（p＜0.01），說明該模型造模成功。與模型組比較，中、高劑量組和陽性對照組小鼠肝勻漿中TG含量極顯著降低（p＜0.01）。

已有文獻報道，枳椇子水提液可顯著（p＜0.05）降低醉酒小鼠肝臟TG含量，并降低注射四氯化碳后小鼠肝臟TG含量，說明其可緩解肝臟TG含量偏高[15-16]；桑椹可顯著（p＜0.01）降低高脂飼料喂養(yǎng)大鼠的血和肝中TG含量[17]；金銀花、枳椇子和青果提取物配伍高劑量組可顯著（p＜0.05）降低醉酒小鼠血清與肝臟中TG含量[12]；由此可知，枳椇子、桑椹和青果都有降低大鼠、小鼠肝臟TG含量，與模型組相比效果或高或低。

本實驗中，復方體現(xiàn)了單一原料在降低肝臟TG含量的作用，各劑量組都表現(xiàn)出降低醉酒小鼠肝臟TG含量，并且中、高組都達到極顯著水平（p＜0.01）。高劑量組中TG含量較模型組降低42.9%，說明此復方可降低醉酒小鼠肝臟組織TG含量，減輕肝臟脂肪堆積，起到保護肝臟的作用。

表4 受試樣品對小鼠肝組織中TG含量的影響Table 4 Effect of the tested samples on TG in mice hepatic tissues

2.5 復方組合物對乙醇脫氫酶活性的影響

乙醇脫氫酶（ADH）活性被作為一項重要的檢測指標，觀察復方組合物對ADH是否具有誘導和激發(fā)作用。由表5可知，與空白組比較，模型組小鼠灌胃白酒后，肝臟ADH活性有所降低（p＜0.01），造模成功。陽性對照組和低、中、高劑量組中ADH活性相比于模型組和空白組有顯著提高（p＜0.01）。

已有文獻報道，枳椇子的水提液、醇提物、乙酸乙酯提取物和多糖都具有顯著（p＜0.05）提高醉酒小鼠肝臟ADH活性的作用，但活力未超過正常組表現(xiàn)[18-20]；桑椹果飲可顯著（p＜0.05）提高醉酒小鼠肝臟ADH活性，并高于正常組，說明其可激活ADH活性[21]；由此可知，枳椇子和桑椹表現(xiàn)出顯著（p＜0.05）提高醉酒小鼠肝臟ADH活性。

本實驗中，復方各劑量組小鼠肝臟ADH活性較模型組和空白組都有極顯著（p＜0.01）提高，效果優(yōu)于文獻中枳椇子、桑椹單獨作用的效果。高劑量組中ADH活性較空白組和模型組提高60%和77.8%，說明復方組合物不僅能保持小鼠肝臟ADH活性，還能激發(fā)ADH的活性，加速乙醇在體內代謝，降低乙醇對機體的負面影響。

表5 受試樣品對小鼠肝組織中ADH活性的影響Table 5 Effect of the tested samples on ADH in mice hepatic tissues

本實驗中復方組合物由枳椇子、桑葚和青果的提取物組成，中醫(yī)認為，枳椇子具有解酒毒、解渴、降壓利尿、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜等功效[22]；桑椹具有解除酒精中毒、保護肝臟和腎臟免受損傷、強健骨骼等作用[23]；青果主要有防醉、消炎止痛和解除毒素的作用[24]。三種植物各自具有不同程度的提高肝臟GSH，降低MDA、TG含量，提高ADH活性的作用，發(fā)揮解酒保肝功效。結合以上結果可知，復方組合物集合了復方中三種植物的優(yōu)勢，超過單一組分的表現(xiàn)，對小鼠表現(xiàn)出良好的保肝護肝作用。

3 結論

經過高、中、低劑量復方組合物灌喂小鼠30d后，通過白酒灌胃造成小鼠肝組織中谷胱甘肽、丙二醛、甘油三酯含量和乙醇脫氫酶活性較正常狀態(tài)明顯異常，并測定此四項指標評價復方組合物的保肝作用。結果顯示，復方組合物可顯著降低小鼠肝組織中丙二醛和甘油三酯的含量，升高還原型谷胱甘肽含量，激發(fā)乙醇脫氫酶活性，并表現(xiàn)出一定劑量相關性。說明本研究中復方組合物能加速體內乙醇的代謝分解，提高肝臟抗氧化活力，減少脂肪堆積，具有保肝功效。本復方中桑椹、青果、枳椇子為藥食同源植物，能為開發(fā)解酒保肝類保健食品提供一定參考。

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Hepatoprotective effect of mixture of Hovenia duleis，Morus alba，and Canarium album on liver of mice

TANG Hui-hui1，2，JIN Mei-dong3
（1.Tourism College，Huangshan University，Huangshan 245021，China；2.School of Tourism and Culinary Science，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China；3.School of Education Science，Huangshan University，Huangshan 245021，China）

The hepatoprotective effect of mixture from water extracts of Hovenia duleis，Morus alba，and Canarium album（mass ratio of 2.2∶3.8∶2.8）on mice was studied.Mice were reared with the mixture through stomach perfusion for 30 day，and mice were treated with white wine by gastric perfusion.The contents of GSH，MDA，TG and the enzyme activity of ADH were determined to evaluate the mixture.The results showed that high，middle，low dose groups of the mixture could significantly increase GSH（p＜0.01）in liver of mice，and decrease MDA（p＜0.01）.However，high，middle dose groups could significantly decrease TG（p＜0.01）.High，middle，low dose groups could significantly activated ADH（p＜0.01）in liver of mice.The mixture performed the hepatoprotective effect on mice.The work provided a strong data support for the hepatoprotective effect of the mixture.In addition，all of three plant materials in the mixture are the medicinal and edible plant，which could be developed as hepatoprotective health food.

hepatoprotective effect；Morus alba；Canarium album；Hovenia duleis；mixture

TS201.4

A

1002-0306（2014）12-0354-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.069

2013－11－21

唐暉慧（1987-），女，碩士研究生，助教，研究方向：食品營養(yǎng)與烹飪性能研究。

黃山學院校級科研基金項目（2013xkj004）。