蓖麻毒蛋白前體基因的時空表達模式分析

（湖南農業大學生物科學技術學院，長沙410128）

蓖麻毒蛋白前體基因的時空表達模式分析

金璐，邢超，劉陽，莫祎，阮穎*

（湖南農業大學生物科學技術學院，長沙410128）

蓖麻毒蛋白（Ricin）是一類異二聚體復合物，包括一條具有催化活性的A鏈和具有半乳糖識別功能的B鏈，具有劇毒性。以RC2蓖麻為材料，利用半定量PCR和定量PCR技術分析蓖麻毒蛋白前體基因的時空表達模式。結果表明，在苗期蓖麻各組織中蓖麻毒蛋白前體基因不表達，而在成熟開花植株的各組織部位中，只在根和種子中有表達；而在種子發育過程中，授粉后1～2 d內，子房中蓖麻毒蛋白前體基因有表達，之后伴隨種子生長發育特異性表達消失；授粉后24 d，蓖麻毒蛋白前體基因再次表達，并且表達量快速增高。這一規律的發現為進一步研究蓖麻毒蛋白合成積累以及選育低毒蓖麻提供了重要參考。

蓖麻；毒蛋白前體基因；半定量PCR；定量PCR；基因表達

蓖麻（Riciuns communis L.），屬大戟科（Euphorbiaceae）雙子葉一年或多年生草本植物。蓖麻種子中含60%的蓖麻油，可用作合成數以百計的各種化學衍生物，有“綠色石油”之稱。去油后的蓖麻餅粕富含各種氨基酸，粗蛋白含量約為30%～40%，是普通糧食作物的3倍，但因餅粕中含有蓖麻毒蛋白（Ricin）這種劇毒性物質致使蓖麻餅粕不能直接用于配合飼料生產，需經脫毒處理［1～3］。

蓖麻毒蛋白是一種天然致命毒素，對所有哺乳動物的有核細胞都具有毒害作用。蓖麻毒蛋白屬于Ⅱ型核糖體失活蛋白（ribosome inactivating protein，RIP）。蓖麻毒素是從蓖麻籽中提取的植物糖蛋白，分子量64 000［4］。毒素由A和B兩條多肽鏈組成，兩鏈間由一個二硫鍵連接。目前，A鏈和B鏈的氨基酸序列以及二級結構已基本清楚。毒素B鏈上含有兩個半乳糖或半乳糖殘基結合位點，可和細胞表面的含半乳糖殘基的受體結合，通過內陷作用進入細胞質，發揮毒性作用。蓖麻毒素A、B鏈上還分別含有1和2個糖支鏈，鏈末端均為甘露糖殘基，可以和網狀內皮細胞特別是巨噬細胞結合［5，6］。后者細胞表面富含甘露糖受體，可優先攝取蓖麻毒素，這對于毒素發揮生物功能有重要的作用。研究表明，蓖麻毒蛋白由蓖麻毒蛋白前體合成，經修飾后主要儲存在種子的胚乳細胞中［7，8］。從已經發表的資料來看，現在還缺乏對蓖麻毒蛋白在蓖麻植株中的系統時空表達研究資料。

筆者在蓖麻植株及蓖麻種子生長發育過程中，通過對蓖麻毒蛋白前體基因的時空表達進行系統研究，確定其時空表達模式，尋找出蓖麻毒蛋白合成積累與蓖麻植株生長發育過程間的規律，以為進一步研究其規律以及培育低毒蓖麻新品系奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為蓖麻（Riciuns communis）RC2，由本校植物代謝調控與代謝工程實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 植物培養條件

將RC2蓖麻種子播種于裝有營養土的小缽中，置于生長室中萌發生長，后將萌發生長出子葉的幼苗移栽至大缽中，置于溫室內生長，生長條件是溫度25～35℃，長日照（14 h光／10 h暗），定期澆水及營養液。

1.2.2 取材

蓖麻苗期材料的收集。將蓖麻種子播種于小缽內，置于生長室，生長到14 d后，取其子葉和根；生長到20 d后，取其第一片真葉；待其繼續生長7 d后，取其莖。

成熟植株和種子不同發育階段的取材。待蓖麻植株生長至開花期，分別取其根、莖、葉及受精前1 d的雌花。待其開花后，采用人工授粉法并記錄授粉時間（day after pollination，DAP），取1、3、5、7、9、11、13和15 DAP的子房，及18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40 DAP的種子。

1.2.3 蓖麻RNA提取及cDNA合成

在無菌環境下，采用RNA Extraction Buffer法［9］提取蓖麻不同生長時期、不同器官的RNA，溶于Free-RNase水中，-80℃保存。根據RNA逆轉錄試劑盒（Fermentas公司）操作說明，合成cDNA，用于半定量和定量PCR檢測。

1.2.4 序列分析及引物設計

在NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）中找到蓖麻ACTIN全長CDS序列，設計ACTIN引物。

RC ACTIN F：5′-ATTTCCAAGGGCGAGTATG AC-3′

RC ACTIN R：5′-CCTTTACTGACTCCCACCT CC-3′

在NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）中找到蓖麻RICIN前體基因完整CDS序列，在基因庫中進行BLAST比對和運用MEGA5.1軟件分析比較，尋找序列中具有高保守性的區域，設計一對RTPCR引物和一對RT-qPCR引物。

Ricin F：5′-AATATACGGGAAACAGTTGTCAA GA-3′

Ricin R：5′-GCACAACTATTGTCTTGTGCATT CT-3′

Q-Ricin F：5′-ATAGTGGGTTGGTGTTAGAT GTGAG-3′

Q-Ricin R：5′-GTGCTCTTATTAGATACTGG ACTGC-3′

1.2.5 半定量PCR和定量PCR檢測

半定量PCR檢測：測定并調節cDNA濃度至800 ng／μL，用2×Taq MasterMix（康為世紀生物公司）和半定量引物Ricin F／Ricin R擴增目的片段，預期目的片段354 bp。反應體系（15μL）：Ricin F／Ricin R 0.25／0.25μL，2×Taq MasterMix 7.5μL，H2O 6μL，cDNA 1μL。反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性40 s；56℃退火40 s；72℃延伸40 s；72℃終延伸5 min，反應從第二步至第四步循環28次。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

定量PCR檢測：測定cDNA濃度并稀釋至5 ng／μL，用2×SYBR Green／Fluorescein qPCR Master Mix（Thermo公司），儀器及分析軟件為iQ5（Bio-Rad），以引物RC ACTIN F／R為內參，定量PCR引物Q-Ricin F／Q-Ricin R檢測目的片段，預期目的片段189 bp。反應體系（20μL）：引物F／R 0.5／0.5 μL，2×SYBR Green Master Mix 10μL，H2O 6μL，cDNA 3μL。反應條件：Cycle1 95℃10 min；Cycle2 95℃10 s；60℃1 min，40個循環數；Cycle3 95℃1 min；Cycle4 60℃1 min；Cycle5 60℃10 s，71個循環數。其相對表達量以2ΔΔCT法計算［10］。

2 結果與分析

2.1 蓖麻毒蛋白前體基因的序列分析

經BLAST比對后，找到22條高同源性且具有完整表達框的序列，通過分析，發現在序列CDS區3′端含有一段最為特異的序列（圖1），故選取此段作為目的檢測區域。

圖1 蓖麻毒蛋白前體基因高保守序列Fig.1 The conserved sequence ofRICINprecursor gene

2.2 蓖麻毒蛋白前體基因在苗期不同部位的表達

以蓖麻成熟種子為對照，對苗期的根、莖、真葉和子葉定量檢測，結果顯示在這些幼嫩的組織中基因的表達幾乎檢測不到，說明在蓖麻生長初期蓖麻毒蛋白前體基因在各組織中并不表達。

2.3 蓖麻毒蛋白前體基因在開花期植株不同部位的表達

利用半定量PCR，以ACTIN為內參，檢測蓖麻開花期成熟根、莖、葉和授粉前1 d的雌花以及成熟的種子中蓖麻毒蛋白前體基因的表達情況。結果顯示：蓖麻毒蛋白前體基因在成熟的根及種子內有表達，但在根中的表達量相比種子明顯較弱，而成熟的莖、葉和未授粉的花中并未檢測到基因轉錄產物（圖2）。說明在開花期成熟植株的組織器官中，蓖麻毒蛋白前體基因在種子和根中有表達，而在其它部位沒有蓖麻毒蛋白前體基因的表達。

圖2 蓖麻開花期不同成熟組織中蓖麻毒蛋白前體基因的表達結果Fig.3 Expression level ofRICINprecursor gene in differentmaturing tissues at floweringstage ofRiciuns communis

2.4 蓖麻毒蛋白前體基因在授粉后15 d內子房中的表達

蓖麻進入開花期后，采用人工授粉法并記錄授粉時間，分別取授粉前1 d的雌花和授粉后1、3、5、7、9、11、13和15 d的子房。授粉后5 d，子房明顯膨大，變綠并且表面出現雕紋。取上述材料，分別提取總RNA，反轉錄為cDNA，以ACTIN為內參，通過半定量PCR檢測蓖麻毒蛋白前體基因的表達情況（圖3）。結果顯示：蓖麻毒蛋白前體基因在授粉后1 d有表達，2 d后亦有表達，但表達漸弱；而其他發育時期都未檢測到蓖麻毒蛋白前體基因轉錄產物。說明在子房授粉后15 d內，在前期1～2 d內，蓖麻毒蛋白前體基因有表達，表達由強變弱；從第4～15 d，前體基因表達消失。

圖3 蓖麻毒蛋白前體基因在蓖麻子房授粉后15 d內的表達Fig.3 Expression level ofRICINprecursor gene in caster fertilized ovary w ithin 15 DAP

2.5 蓖麻毒蛋白前體基因在種子授粉18 d后的表達

對授粉后18～40 d的種子樣品進行定量PCR檢測，結果顯示：以蓖麻成熟種子為對照，18～22 d的蓖麻種子中蓖麻毒蛋白前體基因表達量極低，24 d之后蓖麻毒蛋白前體基因表達量急劇增加，40 d的表達量幾乎達到了種子中的40倍（圖4）。

圖4 蓖麻毒蛋白前體基因在蓖麻子房授粉18 d后的相對表達結果Fig.4 The relative expression level of RICIN precursor gene in caster fer tilized ovary after 18 DAP

3 討論

蓖麻毒蛋白（Ricin）由蓖麻毒蛋白前體轉化而來，前體基因主要編碼三個功能區域，包括一個含有催化活性的N-端RIP結構域和兩個具有糖識別功能的C -端凝集素結構域［11］。已有報道顯示，蓖麻毒蛋白家族中可能含有28個可編碼相似功能區域的假定家族成員，包括一些假基因和基因片段［12］。而我們從蓖麻基因組數據庫中，提取所有蓖麻毒蛋白前體基因的同源序列，從中選取了22個具有完整讀碼框序列進行BLAST分析，根據比對結果，以高度保守的序列為基礎，設計了蓖麻毒蛋白前體基因表達檢測的引物對。通過定量和半定量PCR檢測，發現苗期的根、莖、真葉和子葉中沒有表達；在開花期的成熟植株中，只在種子和根中有明顯表達，這種表達模式可能有利于降低蓖麻根與種子受到害蟲的取食。綜合半定量與定量PCR的結果，在授粉后，蓖麻種子的不同發育階段，蓖麻毒蛋白前體基因的表達具有明顯特征：授粉后第1 d表達量快速上升，但是第2 d表達量開始下降，第3 d表達停止，一直到授粉后第22 d，蓖麻毒蛋白前體基因又重新開始表達，并且表達量急劇上升，這種表達模式有利于后期蓖麻種子中蓖麻毒蛋白的大量積累。根據蓖麻毒蛋白前體基因的這種表達模式，推測該基因可能主要是在種子的胚乳組織中表達。因為在成熟的蓖麻種子中，主要貯存物的合成積累是在胚乳細胞中。已有報道發現在種子內胚乳發育首先形成無核胚乳，然后進入胚乳游離核細胞化階段，最后逐漸發育為成熟的胚乳細胞，這一過程中伴隨著油和蛋白的合成代謝［13，14］。在授粉后的前19 d，蓖麻種子迅速生長，其中含有約占90%的水和少量的淀粉，胚乳處于無核期，并在10～18 d內有一個重要的轉化時期，主要以淀粉代謝為主轉化為以脂肪酸代謝為主的過程；在授粉后24～40 d，胚珠退化，胚發育完成，無核胚乳細胞化，胚乳占據了種子的大部分體積，早期在胚珠中儲存的淀粉也逐漸代謝為油脂儲存在胚乳中，同時蛋白質也在逐漸積累增加［14］。在這期間，蓖麻毒蛋白前體基因的表達量也急劇上升，正好與胚乳的發育和胚乳中蛋白質積累模式相一致，因此蓖麻毒蛋白應該主要在胚乳中合成和儲藏。授粉后40～54 d，胚乳細胞繼續發育，但已無明顯的變化［15］。

本實驗還發現，蓖麻毒蛋白前體基因在授粉后第1 d有明顯表達，至授粉后第3 d表達終止。這種授粉受精后的短暫表達，是什么原因引起的，是在什么部位完成的？都有待進一步研究確認。

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Analysis on Spatiotem poral Expression Patterns of RICIN Precursor Gene of Ricinus communis

JIN Lu，XING Chao，LIU Yang，MO Yi，RUAN Ying*

（College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

RICIN，a heterodimeric complexwith hypertoxicity，is composed of one bind of A-chain with catalytic activity and one bind of B-chain with recognition function for galactose.In this paper，the temporal and spatial expression patterns of RICIN precursor gene in Ricunus communis was analyzed by semi-quantitative RT-PCR and real-time quantitative PCR with caster RC2 asmaterial.The results showed that the RICIN precursor gene did not express in any tissues at seedling stage，and only in the roots and seeds at the flowering stage.During the seed developing progress，the RICIN precursor gene expressed in ovaries within 1～2 days after pollination（DAP），and then silenced with the development of seeds.While on 24 DAP，the RICIN precursor gene re-expressed and the expression levelwas rapidly increased.This discovery provides important references for further research on synthesis and accumulation of RICIN and breeding of low-toxicity caster strains.

Riciuns communis；RICIN precursor gene；Semi-quantitative RT PCR；Real-time quantitative PCR；Gene expression

Q786

A

1001-5280（2014）03-0254-05 DOI：10.3969／j.issn.1001-5280.2014.03.06

2014 03 12

金 璐（1989-），女，山西五臺縣人，碩士研究生，Email：jinlu425＠163.com。*通信作者：阮穎，教授，Email：yingruan＠hotmail.com。

國家973項目（2011CB111514）。