根腫菌侵染對(duì)莖瘤芥（榨菜）根系玉米素和吲哚乙酸含量的影響

黃 蕓 徐 莉 肖崇剛 劉翠平 陳國(guó)康

（西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶 400716）

根腫菌侵染對(duì)莖瘤芥（榨菜）根系玉米素和吲哚乙酸含量的影響

黃 蕓 徐 莉 肖崇剛 劉翠平 陳國(guó)康*

（西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶 400716）

以根腫菌侵染的莖瘤芥（榨菜）為試材，采用高效液相色譜法研究了根腫菌侵染對(duì)莖瘤芥內(nèi)源激素含量的影響。結(jié)果表明：根腫菌侵染后莖瘤芥根系玉米素（ZT）含量和吲哚乙酸（IAA）含量均明顯升高，ZT含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，45～60 d時(shí)遠(yuǎn)高于健康植株，其峰值出現(xiàn)在第50天，約為健康植株根系ZT含量的3倍；IAA含量則在55 d后開始升高，其峰值出現(xiàn)在第70天，約為健康植株根系IAA含量的4倍；侵染后第85天，發(fā)病植株根系ZT含量和IAA含量均下降至與健康植株相近。

莖瘤芥；根腫病菌；吲哚乙酸；玉米素

榨菜是以莖瘤芥〔Brassica juncea（L.）Czern. et Coss．var．tumida Tsen et Lee〕為原料制成的加工制品，與歐洲酸菜、日本酹菜并稱世界三大名腌菜。自1994年重慶涪陵地區(qū)發(fā)生根腫病以來(lái)，病害逐年加重，給莖瘤芥生產(chǎn)造成很大損失，目前已成為危害莖瘤芥生產(chǎn)的主要病害（高明泉 等，2002；肖崇剛 等，2002）。莖瘤芥根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）侵染引起的一種世界性病害（Chiang et al．，1977；Kim & Oh，1997）。由于根腫菌為活體寄生菌，不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，因而對(duì)該病菌各方面的研究較受限制，尚未了解其確切的致病機(jī)理，以至于對(duì)該病沒(méi)有切實(shí)有效的防治方法。植株受根腫菌侵染后主根或側(cè)根薄壁組織膨大，形成腫瘤（王旭祎等，2002），表明其致病機(jī)理與內(nèi)源激素，尤其是與生長(zhǎng)素及細(xì)胞分裂素有重要聯(lián)系。Dekhuijzen 和Overeem（1971）最早發(fā)現(xiàn)擬南芥被根腫菌侵染后

細(xì)胞分裂素濃度明顯上升。根瘤形成的過(guò)程中，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的含量和比例起著決定作用，根瘤形成早期細(xì)胞分裂素起主導(dǎo)作用，后期生長(zhǎng)素則起主導(dǎo)作用（Ludwig-M ü ller et al．，2009）。用基因芯片方法研究表明，寄主受根腫菌侵染后兩個(gè)細(xì)胞分裂素氧化脫氫酶基因（AtCKX1和AtCKX6）下調(diào)表達(dá)（Siemens et al．，2006），對(duì)細(xì)胞分裂素的降解減弱，導(dǎo)致其濃度升高。Ando等（2005）發(fā)現(xiàn)，白菜型油菜（B．rapa）被根腫菌侵染后異戊烯基轉(zhuǎn)移酶被誘導(dǎo)表達(dá)，該酶是細(xì)胞分裂素合成的關(guān)鍵酶。蛋白組學(xué)方面的研究發(fā)現(xiàn)，寄主受根腫菌侵染后黑芥子酶（生長(zhǎng)素合成相關(guān)酶）的合成明顯上升，猜測(cè)黑芥子酶的合成還可能與外生信號(hào)有關(guān)聯(lián)（Devos et al．，2006）。另外，調(diào)控兩種腈水解酶合成的基因（NIT1 和NIT2）也存在明顯的上調(diào)表達(dá)現(xiàn)象（Siemens et al．，2006）。且擬南芥NIT1 突變體被根腫菌侵染后，IAA 含量比野生擬南芥被侵染后的低，病狀相對(duì)較輕（Grsic et al．，1999）。本試驗(yàn)以根腫菌侵染的莖瘤芥為試材，研究了根腫菌侵染對(duì)莖瘤芥生長(zhǎng)前期植株內(nèi)源激素吲哚乙酸（IAA）和玉米素（ZT）含量的影響，旨在為深入闡明根腫菌的致病機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

莖瘤芥腫根采集自重慶市涪陵區(qū)根腫病發(fā)病較重地塊。將采回的腫根洗凈，切取腫瘤部分，除去木質(zhì)部，存于-20 ℃冰箱備用。

供試莖瘤芥品種為永安小葉，種子由重慶市涪陵區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備 將存于-20 ℃冰箱中的腫根取出，置于24 ℃、黑暗條件下腐爛處理5 d，切碎，加入5倍腫根質(zhì)量的無(wú)菌水稀釋，于組織攪拌機(jī)內(nèi)間歇攪成勻漿（大約15 min），用顯微鏡可觀察到孢子，確認(rèn)其為蕓薹根腫菌。將孢子濃度調(diào)至1×109個(gè)·mL-1，置于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 接種 在塑料營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)裝上珍珠巖（3/4高度），放置于瓷盤內(nèi)，播種前用水（pH=6.0）充分濕潤(rùn)珍珠巖。在營(yíng)養(yǎng)缽中央用封閉的塑料圓柱體擠出1個(gè)直徑40 mm、高80 mm的圓柱形洞。取適量孢子懸浮液，調(diào)節(jié)pH值為6.0。將孢子懸浮液與滅菌土混合，使每克土壤中含有1×108個(gè)孢子，然后將50 g菌土混合物倒入圓柱形洞中，形成病土芯。對(duì)照組用無(wú)菌土與無(wú)菌水混合后倒入圓柱形洞中，其余條件與發(fā)病組一致。

將催好芽的種子播于營(yíng)養(yǎng)缽中央，澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，在溫度24 ℃、光照16 h·d-1條件下進(jìn)行培養(yǎng)，所有澆灌的水和營(yíng)養(yǎng)液均用32% KOH和1 mol·L-1HNO3調(diào)節(jié)pH值至6.0。每天移動(dòng)1次瓷盤，使其受光均勻。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

播種45 d后開始取樣，將植株拔出，洗凈根部，采用分析天平稱量根系鮮質(zhì)量。以后每隔5 d取1次，共取9次。每次取10株，全根系混合，從中取5 g為1個(gè)樣本，3次重復(fù)。采用高效液相色譜法測(cè)定IAA含量和ZT含量。IAA及ZT的提取、分離和純化參照陳遠(yuǎn)平和楊文鈺（2005）、曾慶錢等（2006）的方法，略有改進(jìn)。提取液用孔徑為0.45 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾，上機(jī)分析。分析柱為ExtendC18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇∶0.6%冰乙酸水溶液=45∶55，柱溫為40 ℃，流動(dòng)相流速0.6 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL。采用峰面積法進(jìn)行定量測(cè)定，3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 根腫菌侵染后莖瘤芥根系鮮質(zhì)量的變化

圖1 根腫菌侵染后莖瘤芥根系鮮質(zhì)量的變化

莖瘤芥受根腫菌侵染后出現(xiàn)明顯病狀，主要表現(xiàn)為發(fā)病植株根系形成腫瘤，腫瘤一般為紡錘形、手指形、不規(guī)則形等，主根上的腫瘤個(gè)大而數(shù)量少，側(cè)根上的個(gè)小而數(shù)量多（王旭祎 等，2002）。由圖1

可知，根腫菌侵染后45～85 d莖瘤芥發(fā)病植株根系鮮質(zhì)量逐步增高；第65～80天健康植株根系鮮質(zhì)量則基本保持不變，而發(fā)病植株根系鮮質(zhì)量仍呈上升趨勢(shì)。由表1可知，第85天健康植株根系鮮質(zhì)量是第45天健康植株根系鮮質(zhì)量的3.5倍，而第85天發(fā)病植株根系鮮質(zhì)量是第45天發(fā)病植株根系鮮質(zhì)量的4.0倍；發(fā)病植株根系鮮質(zhì)量與健康植株根系鮮質(zhì)量之比隨侵染天數(shù)的增加呈上升趨勢(shì)，根腫菌侵染后第80天發(fā)病植株根系鮮質(zhì)量是健康植株根系鮮質(zhì)量的3.1倍。

表1 根腫菌侵染后莖瘤芥根系鮮質(zhì)量的變化

2.2 根腫菌侵染后莖瘤芥根系ZT含量的變化

由圖2可知，莖瘤芥健康植株根系ZT含量基本呈下降趨勢(shì)，但降幅不明顯。發(fā)病植株根系ZT含量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，最大值出現(xiàn)在第50天，為健康植株根系ZT含量的3倍；60～65 d急劇下降；65 d之后趨于平穩(wěn)，并與健康植株根系ZT含量相近。

圖2 根腫菌侵染后莖瘤芥根系ZT含量的變化

2.3 根腫菌侵染后莖瘤芥根系IAA含量的變化

由圖3可知，莖瘤芥健康植株根系IAA含量基本呈下降趨勢(shì)，45～55 d降幅較大，后期趨于穩(wěn)定。發(fā)病植株根系IAA含量在45～55 d時(shí)與健康植株基本相同；55 d后急劇升高，第70天時(shí)達(dá)到峰值，約為健康植株根系IAA含量的4倍；70 d后又迅速下降，85 d時(shí)與健康植株根系IAA含量相差不大。

圖3 根腫菌侵染后莖瘤芥根系IAA含量的變化

3 結(jié)論與討論

根腫菌是一種活體寄生菌，其侵染寄主后的病癥主要表現(xiàn)為根系腫大，推測(cè)其致病機(jī)理與生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素有重要聯(lián)系。前人猜測(cè)根腫菌侵染時(shí)誘導(dǎo)了寄主體內(nèi)生長(zhǎng)素及細(xì)胞分裂素的合成（Williams et al．，1969；Grsic-Rausch et al．，2000）。同時(shí)有證據(jù)顯示，根腫菌并不能提供生長(zhǎng)素，但是可以少量合成細(xì)胞分裂素，這些由根腫菌合成的細(xì)胞分裂素有可能啟動(dòng)了根瘤的形成，但是目前還不清楚這是否是關(guān)鍵的致病因素（王靖 等，2011）。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，根腫菌侵染后莖瘤芥根系IAA含量及ZT含量明顯增加，最高含量分別是健康植株的3倍和4倍。IAA含量和ZT含量增加導(dǎo)致莖瘤芥根系細(xì)胞過(guò)度分裂及增長(zhǎng)，是形成根瘤的重要因素。通過(guò)比較健康植株和發(fā)病植株根系鮮質(zhì)量，可知隨植株自身根系的生長(zhǎng)，腫瘤的質(zhì)量也在增加。這也可以說(shuō)明，根腫菌侵染影響了植株的激素含量，但可能不是因?yàn)槠渥陨泶罅慨a(chǎn)生激素而影響了植株的激素水平，更可能是誘導(dǎo)植株體內(nèi)激素的改變。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，莖瘤芥發(fā)病植株根系ZT含量在受根腫菌侵染50 d時(shí)達(dá)到最高水平，而IAA含量在第70天時(shí)才達(dá)到最高水平，這與前人得出的細(xì)胞分裂素在根瘤形成早期起主導(dǎo)作用，生長(zhǎng)素在后期起主導(dǎo)作用的結(jié)論相似（Ludwig-M ü ller

et al．，2009）。Ugajin 等（2003）檢測(cè)了蘿卜受根腫菌侵染后生長(zhǎng)素含量的變化，45 d后發(fā)病植株根系IAA含量開始下降至平穩(wěn)，這與本試驗(yàn)結(jié)果不同，可能是由于寄主、溫室條件、接種時(shí)間、接種方式不同而致。

若能結(jié)合調(diào)查發(fā)病嚴(yán)重度，試驗(yàn)可更為完善。后續(xù)試驗(yàn)將在激素急劇變化的時(shí)間段進(jìn)一步細(xì)化，分小時(shí)間段檢測(cè)激素含量的變化，并結(jié)合基因調(diào)控研究進(jìn)一步解釋根腫菌的致病機(jī)理，為十字花科作物根腫菌的防治提供理論依據(jù)。

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Effect of Plasmodiophora brassicae Infection on IAA and ZT Contents in Mustard Root

HUANG Yun，XU Li，XIAO Chong-gang，LIU Cui-ping，CHEN Guo-kang*

（CollegeofPlantProtection，SouthwestUniversity，Chongqing400716，China）

The mustard roots infected by Plasmodiophora brassicae were taken as test material．The effect of Plasmodiophora brassicae infection on IAA and ZT contents were measured by HPLC．The result indicated that the IAA and ZT contents increased obviously after Plasmodiophora brassicae infection．The ZT contents showed the changing tendency of first rising then falling．Between 45-60 days，it was much higher than that in the healthy plant，and reached its peak about 3 times in the healthy plant at day 50．The IAA content started to rise after 55 days and reached its peak about 4 times in the healthy plant by day 70．And 85 days after infection，both IAA and ZT contents all reduced to the same level as the healthy plant.

Mustard root；Plasmodiophora brassicae；IAA；ZT

黃蕓，女，碩士研究生，專業(yè)方向：植物病害診斷與控制，E-mail：huangyun3039@126.com

*通訊作者（Corresponding author）：陳國(guó)康，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：十字花科作物根腫病、植物病原線蟲，E-mail：chenguokang@swu.edu.cn

2013-10-22；接受日期：2013-12-02

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201003029），西南大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（XDJK2010C081）