阿爾茨海默病患者腦內p75神經營養因子受體(p75NTR)的表達及與老年斑位置關系的研究

王葉冉，劉雨輝，梁春榮，曾凡，卜先樂，矯樹生，王慶華，姚秀卿，周華東，王延江

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種以皮質、海馬神經元丟失，淀粉樣β蛋白(amyloid β-protein，Aβ)聚集形成老年斑以及Tau蛋白過度磷酸化形成神經纖維纏結為主要病理改變的中樞神經系統變性疾病，是最常見的癡呆類型，臨床主要表現為進行性的認知功能減退，尤其是記憶力下降。p75神經營養因子受體(p75neurotrophin receptor，p75NTR)是腦源性神經營養因子(BDNF)、神經生長因子(NGF)等神經營養因子的受體，是在神經系統發育過程中調控神經元存活與死亡的重要分子。正常成年人腦內p75NTR表達水平很低且主要表達于基底前腦的膽堿能神經元。研究發現，p75NTR也是Aβ的受體，介導Aβ的神經毒性作用，從而引起神經軸突變性和死亡[1]。本研究小組發現，p75NTR在AD轉基因小鼠(APPswe/PS1dE9)腦內表達增高并參與了Aβ沉積的調控[2]。本研究探討p75NTR在AD患者腦內的表達及其與老年斑的空間位置關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 雄性APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠來自美國Jackson動物中心，該小鼠攜帶人致病型淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)和早老素1(presenilin-1，PS1)基因，12月齡相當于AD晚期，以同窩野生型雄性小鼠作為對照。本研究采用的AD患者(4例)和同齡認知功能正常對照(4例)人腦標本由美國Banner Sun Health Institute腦庫提供。本研究人體組織相關研究的臨床試驗注冊號為ChiCTR-OCC-12001966。

1.2 實驗取材 12月齡雄性APPswe/PS1dE9小鼠及同窩雄性野生型小鼠10只，用0.08g/kg戊巴比妥鈉深度麻醉，打開胸腔，從心尖灌注含0.5%NaNO2的磷酸鹽緩沖液100ml，取出大腦，左大腦半球液氮速凍，用含蛋白酶抑制劑的SDS制成勻漿，用于后續Western blotting檢測，右大腦半球置入4%多聚甲醛固定。

1.3 免疫組織化學染色檢測p75NTR的表達 兔源多克隆抗p75NTR抗體(Ab9650)由美國New York大學M. Chao教授提供。石蠟包埋組織塊切片烤干后經二甲苯脫水，0.5%H2O2室溫孵育10min滅活內源性過氧化物酶，甲酸聯合EDTA進行抗原修復，30%馬血清封閉非特異性抗原，與1:500稀釋的p75NTR抗體反應，4℃過夜。洗膜3次，加入1:2000稀釋的生物素標記的鼠抗兔二抗，室溫孵育1h，漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素室溫下孵育1h，洗膜3次，以DAB為底物顯色，經蘇木精復染后進行常規脫水、封片。Olympus顯微鏡觀察，在光強度和聚光器設置保持不變的條件下攝片。用Image J軟件定量分析AD患者腦內p75NTR的表達情況。

1.4 Western blotting檢測p75NTR的表達 將腦勻漿離心后取上清，以SDS-PAGE凝膠行蛋白電泳，電泳完畢將蛋白轉至PVDF上。轉膜后在含5%脫脂奶粉的TBST中封閉1h，TBST洗滌3次，與1:1000稀釋的p75NTR抗體及β-actin抗體反應，4℃過夜。洗膜3次，加1:5000稀釋的二抗，室溫孵育1h，ECL化學發光法顯色，用Image J 軟件分析各條帶光密度值。

1.5 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。計量數據以x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 海馬部位神經元與神經纖維p75NTR的表達AD患者海馬部位可見增粗變性的p75NTR陽性神經纖維末梢，主要位于老年斑的中心部位(圖1A)，而在認知功能正常的對照者海馬內未見增粗變性的神經末梢。在APPswe/PS1dE9轉基因小鼠海馬內也存在類似的增粗變性的神經末梢(圖1D)，而野生型小鼠海馬內未見增粗變性的神經末梢。AD患者和認知正常對照者的海馬中可見深染的p75NTR陽性神經纖維(圖1B、E)。在12月齡APPswe/PS1dE9小鼠海馬內可見增粗的p75NTR陽性神經纖維，而野生型小鼠未見陽性神經纖維(圖1C、F)。在AD患者和認知正常者的海馬內可見p75NTR陽性的神經元，而12月齡APPswe/PS1dE9小鼠和同齡野生型小鼠海馬內未見p75NTR陽性的神經元(圖2)。

2.2 海馬組織勻漿p75NTR表達水平檢測 Western blotting檢測顯示，在人和小鼠海馬組織勻漿中均存在p75NTR表達，其中AD患者表達水平顯著高于認知正常對照者，12月齡APPswe/PS1dE9小鼠表達水平顯著高于同齡野生型小鼠，表明AD患者和APPswe/PS1dE9小鼠腦內p75NTR表達水平增高(圖2)。

3 討 論

p75NTR參與多種神經營養因子的信號傳導，其生理功能取決于所結合的配體和協同受體[1,3-4]。P75NTR與各種神經營養因子及其前體結合參與了多種生理病理過程，與NGF、BDNF、神經營養因子3(neurotrophin-3，NT-3)及NT-4/5結合可以促進神經元的存活，而與它們的前體pro-NGF、pro-BDNF、pro-NT3相互作用可引起神經元的凋亡[5-9]。p75NTR也是Aβ受體，在AD的發生過程中介導Aβ的神經毒性作用，導致神經元凋亡和神經纖維變性[1,10]。我們前期研究發現，p75NTR還具有促進Aβ生成和調控Aβ沉積的作用[2]。因此p75NTR在AD發生過程中參與了Aβ生成、沉積和神經毒性等方面的調控，是AD病理過程中的一個重要受體。

圖1 海馬部位神經纖維p75NTR的表達及其與老年斑的位置關系(DAB ×400)Fig.1p75NTR expression on neurofibrils in hippocampus and its spatial distribution in relation to amyloid plaque (DAB ×400)

圖2 p75NTR在海馬神經元的表達Fig.2Neuronal expression of p75NTR in hippocampus

本研究發現，AD患者和認知正常對照者海馬內均存在表達p75NTR的神經纖維，并觀察了AD患者腦內p75NTR陽性神經纖維與老年斑的關系，發現與APPswe/PS1dE9小鼠一樣，AD患者海馬中變性的p75NTR陽性神經纖維也位于老年斑中心部位。這一現象支持我們既往在動物模型中提出的p75NTR陽性的變性神經纖維可能參與了老年斑形成的假說[2]。

關于p75NTR在AD條件下的表達是增高還是降低，目前尚無定論。p75NTR主要表達于基底前腦的膽堿能神經元及其軸突，由于這些膽堿能神經元在AD腦內死亡最多，因此以往許多研究認為p75NTR在AD腦內的表達應該是降低的[1,11-13]。在本研究中，我們同時將AD患者和APPswe/PS1dE9小鼠腦組織與正常對照比較，結果均表明AD腦內p75NTR表達水平顯著高于對照，表明AD條件下腦內p75NTR的表達水平是增高的。可溶性的Aβ含量在AD起病早期增加[14]，我們推測可能Aβ與p75NTR的結合抑制了p75NTR的降解，從而提高了p75NTR的水平，也可能是Aβ與p75NTR結合本身作為一種信號促進了p75NTR自身基因的轉錄及蛋白表達。最近的研究表明，Aβ可引起人神經母細胞瘤細胞SKSY5Y中p75NTR的表達增加[15]，類胰島素生長因子1受體(insulin-like growth factor 1receptor，IGF-1R)信號通路參與了Aβ對p75NTR表達的上調作用[16]。

雖然大多數證據表明Aβ是AD的核心致病物質，但在各種APP轉基因小鼠模型中，盡管腦內出現Aβ過度產生和老年斑形成，卻并無明顯的神經元丟失和腦萎縮[17]。對于這一現象目前尚無合理解釋。本研究發現在人(AD患者和認知正常對照者)海馬神經元上p75NTR表達明顯，而老齡APPswe/PS1dE9及野生型小鼠海馬神經元未見明顯p75NTR表達。這一人與小鼠的差異現象對于解釋AD動物模型和AD患者神經元死亡及腦萎縮方面的差異具有重要的意義。由于p75NTR是Aβ的受體，介導Aβ引起的神經元變性死亡，人腦神經元表達較高水平的p75NTR，而小鼠腦內神經元p75NTR表達水平低，提示人腦神經元可能比小鼠神經元對Aβ的神經毒性更為敏感，從而在AD患者腦內出現大量神經元死亡和腦萎縮，而過表達Aβ的轉基因AD動物無明顯神經元死亡和腦萎縮。

最近有研究報道體外培養的基底前腦神經元中p75NTR能夠介導Aβ的內吞及其在溶酶體的降解[18]，提示p75NTR在Aβ的中樞清除機制中具有重要的作用。Aβ是AD的核心致病物質，p75NTR參與了Aβ的生成、沉積、降解、清除及神經毒性作用，在AD的發生發展中具有重要作用，可能成為一個新的AD治療靶點。

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