精神分裂癥患者血漿miRNA表達水平與精神癥狀的關系研究

宋紅濤，過偉，孫欣羊，張梁，趙林，鐘愛芳，牛威，戴運華，張理義，盧正斌

miRNA是一類長度在22nt左右，能夠調控編碼區蛋白表達水平的內源性小分子RNA[1]。miRNA通過與目標mRNA互補配對，在轉錄后水平對基因表達進行負調控，導致目標mRNA降解或翻譯抑制：當miRNA與mRNA不完全互補時，將導致翻譯抑制；當miRNA與mRNA完全互補時，則導致目標mRNA降解[2]。單個miRNA分子能夠調節幾百個基因位點，而miRNA的整體網絡則可調節50%～60%的轉錄過程[3]。miRNA憑借其在轉錄后水平對基因表達的調控，在機體生物信息網絡中扮演著重要角色，與多種精神疾病的發生發展有著密切聯系[4]。病例對照研究證實，精神分裂癥患者體內存在多種miRNA的表達異常[5]，miRNA調控多種精神分裂癥的易感基因，與精神分裂癥的發生發展存在明顯關聯[6]。目前精神疾病的診斷主要以癥狀學為標準，精神分裂癥患者血漿中miRNA的表達水平與其精神癥狀的相關性鮮見報道。本研究在詳細查閱國內外文獻的基礎上，結合生物信息學技術(miRNA靶基因預測軟件，如TargetScan、miRanda、miRbase等)，選擇9種在精神分裂癥患者體內差異表達顯著的miRNA(miR-30e、miR-34a、miR-181b、miR-195、miR-346、miR-432、miR-7、miR-132、miR-212)進行分析，探討其與精神癥狀的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2012年7月－2013年5月解放軍102醫院精神科門診收治的精神分裂癥患者。入組標準：①符合美國精神疾病診斷和統計手冊第4版(DSM-Ⅳ)精神分裂癥診斷標準；②首發病例或入組前3個月未服用抗精神病藥物；③年齡15～60歲。排除標準：①患有其他精神疾病；②患有腦外傷等軀體或神經系統疾病；③有酗酒或藥物濫用史；④入組前1個月內有輸血史；⑤入組前3個月內使用過無抽搐電休克治療(MECT)。共入組53例患者，其中男28例，女25例，年齡15～56(27.5±10.8)歲。本研究獲得解放軍102醫院醫學倫理委員會批準，所有受試者或受試家屬(監護人)均簽署知情同意書。

1.2 陽性和陰性癥狀量表(PANSS)[7]評估 PANSS由陽性量表7項(P1-P7)、陰性量表7項(N1-N7)和一般精神病理量表16項(G1-G16)，附加3個評定攻擊危險性的補充項目(S1-S3)組成，包括反應缺乏、思維障礙、激活性、偏執、抑郁和補充(攻擊性)6個癥狀群。每個項目按其精神病理水平遞增的7級評分為：1-無，2-很輕，3-輕度，4-中度，5-偏重，6-重度，7-極重度。

1.3 主要試劑及儀器 miRNeasy血清/血漿提取試劑盒、miRNeasy血清/血漿外參(德國Qiagen公司)；TaqMan MicroRNA Assays、TaqMan通用混合試劑盒Ⅱ、TaqMan MicroRNA反轉錄試劑盒(美國ABI公司)。ABI 9700型PCR儀、ABI 7900HT Fast Read-Time PCR System(美國ABI公司)；天美CT14RD型臺式高速冷凍離心機(上海天美生化儀器設備工程有限公司)；NanoDrop1000超微量紫外分光光度計(美國Thermo公司)；WH-2微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；JS-400A恒溫金屬浴(上海培清科技有限公司)；DK-8D數顯恒溫水浴鍋(金壇市醫療儀器廠)；SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺(蘇凈凈化設備有限公司)；－80℃超低溫冰箱(日本三洋公司)；Eppendorf移液槍(德國Eppendorf公司)；Andy Bio掌上離心機(美國Andy Bio公司)。

1.4 總RNA抽提與熒光定量PCR反應 所有被試者均于用藥前使用EDTA抗凝管采集肘靜脈血5ml，室溫下(15～20℃)離心，將取得的血漿置于－80℃冰箱保存備用。按照miRNeasy血漿提取試劑盒說明書從血漿中提取總RNA，為了避免抽提步驟導致RNA的含量誤差，加入miR-39血漿外參試劑盒進行校正[8-9]。依照TaqMan microRNA反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，按照TaqMan通用混合試劑盒Ⅱ說明書進行實時熒光定量PCR反應，通過ABI 7900型PCR儀測定Ct值，每個反應重復2次。以miRNA與外參miR-39[8-9]之間Ct值的差值(ΔCt)表示miRNA的相對表達水平。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，采用Pearson相關分析、獨立樣本t檢驗、多元逐步回歸分析miRNA和精神癥狀的關系，所有統計分析均為雙側顯著性檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 精神分裂癥患者血漿中miRNA表達水平與各癥狀群及量表總分的相關性分析 Pearson相關分析顯示，miR-346的表達水平與一般精神病理總分呈顯著負相關(r=–0.282，P＜0.05)；miR-34a的表達水平與激活性癥狀群和攻擊性癥狀群呈顯著負相關(r=–0.345，r=–0.284，P＜0.05)，余miRNA表達水平與各癥狀群及量表總分無明顯相關性(P＞0.05)。

2.2 miR-34a和miR-346高表達組、低表達組各癥狀群及量表總分比較 求出研究對象miR-34a和miR-346表達水平的四分位數，將miR-34a和miR-346的表達水平低于或等于第一四分位數(QL=P25)者分別歸為miR-34a、miR-346低表達組，高于或等于第三四分位數(QU=P75)者分別歸為miR-34a、miR-346高表達組，對高表達組和低表達組的各癥狀群及量表總分進行比較，結果顯示，miR-34a高表達組的激活性癥狀群和攻擊性癥狀群分值低于低表達組，miR-346高表達組反應缺乏癥狀群分值低于低表達組，差異有統計學意義(表1)。

2.3 miRNA對精神癥狀群影響的逐步回歸分析以miRNA表達水平為自變量，以一般精神病理總分、反應缺乏癥狀群、激活性癥狀群和攻擊性癥狀群為因變量進行逐步回歸分析(自變量選入標準為0.05，剔除標準為0.10)，結果顯示，miR-346進入以一般精神病理為因變量的回歸方程，可解釋一般精神病理變異的6.1%，miR-34a分別進入以激活性癥狀群和攻擊性癥狀群為因變量的回歸方程，分別可解釋激活性癥狀變異的10.2%、攻擊性癥狀群變異的6.3%(表2)。

表1 miR-34a和miR-346高表達組、低表達組各癥狀群及量表總分比較的(n=13)Tab. 1Comparison of syndrome scores and total score in miR-34a and miR-346high- and low-expression groups (n=13)

表2 miRNA對精神癥狀群影響的逐步回歸分析Tab. 2Stepwise regression analysis of the effects of miRNA expression on mental syndromes

3 討 論

迄今為止，研究者相繼在植物、動物和微生物中發現了大量的miRNA分子，并且數量在不斷更新。據計算機推測，人類基因組可能存在1000多個miRNA基因，單個miRNA可調控200多個靶基因，miRNA對60%以上的基因起調控作用，在轉錄后水平能夠精確調控30%以上蛋白質編碼基因的表達[10]，這使得miRNA成為最大的一類基因表達調控因子。miRNA具有較強的發育時序特異性和組織特異性[11-12]，在中樞神經系統的發育和神經元的分化過程中起著十分重要的作用[13-15]。miRNA不僅參與多種神經功能的調節[16]，還與突觸可塑性有關[17]。在腦皮質發育時，一些miRNA的表達會隨著皮質形成過程中的細胞增殖、區域性分化和傳導通路的建立而發生變化[18]，對大腦的發育和功能調節起至關重要的作用[19]。

有研究證實，miRNA的表達和調控異常與精神分裂癥的發生發展有著密切聯系。Kim等[20]研究發現，與對照組比較，精神分裂癥組有7個miRNA(miR-7、miR-34a、miR-132、miR-132*、miR-154*、miR-212和miR-544)表達有升高。Lai等[21]研究發現，精神分裂癥患者外周血中有7個miRNA表達存在異常(hsa-miR-34a、miR-449a、miR-564、miR-548d、miR-572、miR-652上調，miR-432下調)，其中一部分與精神分裂癥患者的陰性癥狀、神經認知功能障礙和錯配消極表現呈顯著相關。作為精神疾病診斷標準的DSM-Ⅳ和CCMD-Ⅲ主要以癥狀學為診斷依據，而隨著研究的不斷深入，越來越多的證據顯示，精神分裂癥可能與miRNA的表達異常有關，但精神分裂癥患者體內miRNA的表達水平與其精神癥狀的關系卻研究甚少。

文獻報道，miR-34a可能參與精神分裂癥的發病過程[20-21]。本研究結果顯示，miR-34a與精神分裂癥患者的激活性癥狀群及攻擊性癥狀群有明顯關聯，血漿miR-34a表達水平能夠預測患者10.2%的激活性癥狀群和6.3%的攻擊性癥狀群，提示miR-34a可能在精神分裂癥患者的激活性癥狀群和攻擊性癥狀群的發生發展中起重要作用，但具體機制有待進一步研究。編碼miR-346的基因位于離子型谷氨酸受體Δ1(GRID1)的內含子2上，Zhu等[6]研究發現，精神分裂癥患者體內miR-346和GRID1的表達量均低于正常對照者。本研究結果顯示，miR-346與精神分裂癥患者的一般精神病理癥狀有明顯關聯，血漿miR-346表達水平能夠預測患者6.1%的一般精神病理癥狀。

綜上所述，精神分裂癥患者體內miRNA表達異常與精神分裂癥的發病有明顯關聯。精神分裂癥患者血漿中miR-34a的表達水平與激活性癥狀群和攻擊性癥狀群有明顯關聯，miR-346的表達水平與一般精神病理癥狀有明顯關聯。miR-34a和miR-346可能在上述精神癥狀的發生發展過程中扮演著重要的角色，但其具體作用機制有待進一步深入研究。

[1]Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V, et al. The C. Elegans heterochronic gene lin-4encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J]. Cell, 1993, 75(5): 843-854.

[2]Friedman RC, Farh KK, Burge CB, et al. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs[J]. Genome Res,2009, 19(1): 92-105.

[3]Cheng LC, Pastrana E, Tavazoie M, et al. miR-124regulates adult neurogenesis in the subventricular zone stem cell niche[J]. Nat Neurosci, 2009, 12(4): 399-408.

[4]Miller BH, Wahlestedt C. MiRNA dysregulation in psychiatric disease[J]. Brain Res, 2010, 1338(18): 89-99.

[5]Perkins DO, Jeffries CD, Jarskog LF, et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder[J]. Genome Biol, 2007, 8(2): R27.

[6]Zhu Y, Kalbfleisch T, Brennan MD, et al. A microRNA gene is hosted in an intron of a schizophrenia-susceptibility gene[J].Schizophr Res, 2009, 109(1-3): 86-89.

[7]He YL, Zhang MY. Positive And Negative Symptoms Scale(PANSS) and its application[J]. J Clin Psychiatry, 1997, 7(6):353-355.[何燕玲, 張明圓. 陽性和陰性綜合征量表(PANSS)及其應用[J]. 臨床精神醫學雜志, 1997, 7(6): 353-355.]

[8]Thomson JM, Parker J, Perou CM, et al. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression[J]. Nat Methods, 2004, 1(1): 47-53.

[9]Wang Y, Zheng D, Tan Q, et al. Nanopore-based detection of circulating microRNAs in lung cancer patients[J]. Nat Nanothechnol, 2011, 6(10): 668-674.

[10]Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are miRNA targets[J]. Cell, 2005, 120(1): 15-20.

[11]Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, et al. The 21-nucleotide let-7RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans[J]. Nature, 2000, 403(6772): 901-906.

[12]Wheeler G, Ntounia-Fousara S, Granda B, et al. Identification of new central nervous system specific mouse microRNAs[J].FEBS Lett, 2006, 580(9): 2195-2200.

[13]Bicker S, Schratt G. microRNAs: tiny regulators of synapse function in development and disease[J]. J Cell Mol Med, 2008,12(5a): 1466-1476.

[14]Sempere LF, Freemantle S, Pitha-Rowe I, et al. Expression profiling of mammalian microRNAs uncovers a subset of brainexpressed microRNAs with possible roles in murine and human neuronal differentiation[J]. Genome Biol, 2004, 5(3): R13.

[15]Vo N, Klein ME, Varlamova O, et al. A cAMP-response element binding protein-induced microRNA regulates neuronal morphogenesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(45):16426-16431.

[16]Cheng HYM, Papp JW, Varlamova O, et al. MicroRNA modulation of circadian-clock period and entrainment[J].Neuron, 2007, 54(5): 813-829.

[17]Schratt GM, Tuebing F, Nigh EA, et al. A brain-specific microRNA regulates dendritic spine development[J]. Nature,2006, 439(7074): 283-289.

[18]Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Townsend M, et al. Microarray analysis of microRNA expression in the developing mammalian brain[J]. Genome Biol, 2004, 5(9): R68.

[19]Beveridge NJ, Cairns MJ. MicroRNA dysregulation in schizophrenia[J]. Neurobiol Dis, 2012, 46(2): 263-271.

[20]Kim AH, Reimers M, Maher B, et al. MicroRNA expression profiling in the prefrontal cortex of individuals affected with schizophrenia and bipolar disorders[J]. Schizophr Res, 2010,124(1-3): 183-191.

[21]Lai CY, Yu SL, Hsieh MH, et al. MicroRNA expression aberration as potential peripheral blood biomarkers for schizophrenia[J].PLoS One, 2011, 6(6): e21635.