豐年蟲卵中類胡蘿卜素的提取工藝研究

王添嬌，任丹丹，王 麗，李佰磊，汪秋寬，何云海

（大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧省水產品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧大連116023）

豐年蟲卵中類胡蘿卜素的提取工藝研究

王添嬌，任丹丹*，王 麗，李佰磊，汪秋寬，何云海

（大連海洋大學食品科學與工程學院，遼寧省水產品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧大連116023）

采用木瓜蛋白酶破壁與有機溶劑浸提相結合的方法從豐年蟲卵中提取類胡蘿卜素。通過單因素實驗和正交實驗，考察酶解pH、酶解溫度、酶用量、酶解時間及浸提溶劑用量等因素對提取效果的影響。結果表明，利用酶解與有機溶劑浸提法提取豐年蟲卵類胡蘿卜素的最佳工藝條件為：調節(jié)木瓜蛋白酶pH至6，酶用量為375U/g，在60℃下酶解25min，再采用30mL/g的丙酮浸提。在此條件下，豐年蟲卵中類胡蘿卜素的提取率為0.03mg/g。

豐年蟲卵，類胡蘿卜素，提取

類胡蘿卜素是一類重要的功能性天然色素，它廣泛分布于植物中，動物體內的類胡蘿卜素通常是從植物性食物中獲得的。豐年蟲，又稱鹽水蝦，是一種重要的生物餌料。其卵中含有豐富的蛋白質、氨基酸、粗脂肪等，同時也含有某些類胡蘿卜素[1-3]。養(yǎng)殖戶發(fā)現(xiàn)，給禽類喂食豐年蟲或豐年蟲卵可使禽蛋的蛋黃顏色加深。國內外研究表明，禽蛋的蛋黃顏色與禽類攝食食物中類胡蘿卜素的含量直接相關[4-5]。這表明豐年蟲及其卵中含有豐富的類胡蘿卜素。目前，還未見從豐年蟲卵中提取類胡蘿卜素的研究報道，而豐年蟲卵的卵壁堅硬，不適合用常規(guī)的提取方法進行提取。本文通過酶法破壁及有機溶劑浸提法從豐年蟲卵中提取類胡蘿卜素[6]，探討適用于豐年蟲卵的類胡蘿卜素提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豐年蟲卵 大連鹽化集團；石油醚（沸程60～ 90℃）、丙酮、二甲基亞砜（DMSO） 均為分析純；木瓜蛋白酶 北京化學試劑公司，酶活為15000U/g。

BS2000S型分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；722S型可見分光光度計 上海分析儀器總廠；超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；RE52CS型旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；恒溫水浴鍋 北京金北德工貿有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 破壁實驗 采用不同的方法對豐年蟲卵進行破壁處理，包括直接浸提、堿法破壁、酸法破壁、酶法破壁以及二甲基亞砜破壁[7-10]，從而確定適宜的破壁方法。豐年蟲卵的細胞壁中富含蛋白質、脂肪酸等，且考慮到酸法與堿法對提取率的影響，故在酶法破壁中選取的是適用pH范圍較廣、略偏酸性的木瓜蛋白酶。破壁的液料比均為15m L/g，利用超聲波細胞破碎儀在400W的功率下破壁20m in。破壁后均采用丙酮浸提，石油醚萃取后定容至100m L。利用紫外可見分光光度計做波長掃描，確定其吸收峰所在波長，并在此波長下分別測定其吸光值。

1.2.2 類胡蘿卜素的提取 準確稱取1g豐年蟲卵于燒杯中，加入15m L蒸餾水，加入一定量的木瓜蛋白酶，調節(jié)pH，在一定溫度下水浴一段時間后，利用超聲波細胞破碎儀在400W的功率下破碎20min，再用一定量的丙酮提取并置于分液漏斗內，加入適量石油醚萃取至無色。收集上層石油醚，定容至100m L。利用紫外可見分光光度計在波長為463nm下測定其吸光值。

1.2.3 單因素實驗設計 實驗分別考察酶解pH、酶解溫度、酶用量、酶解時間及浸提溶劑用量等因素對提取效果的影響。在酶解溫度為30℃，酶用量225U/g，酶解時間為20m in，浸提溶劑用量為15m L的條件下調整酶解液的pH分別為4.5、5、6、7、8，考察pH對提取效果的影響；在酶解pH為6，酶用量225U/g，酶解時間為20m in，浸提溶劑用量為15m L的條件下調整酶解液的溫度分別為30、40、50、60、70℃，考察溫度對提取效果的影響；在酶解pH為6，酶解溫度60℃，酶解時間為20min，提取劑用量為15m L的條件下調整酶的用量分別為75、150、225、300、375U/g，考察酶用量對提取效果的影響；在酶解pH為6，酶解溫度60℃，酶用量為225U/g，提取劑用量為15m L的條件下調整破壁時間分別為5、10、15、20、25min，考察破壁時間對提取效果的影響；在酶解pH為6，酶解溫度60℃，酶用量為225U/g，破壁時間為15min的條件下調整提取劑丙酮用量分別為10、15、20、30、40m L，考察丙酮用量對提取效果的影響。

1.2.4 正交實驗 在單因素實驗的基礎上，以pH（A）、溫度（B）、酶用量（C）、破壁時間（D）、丙酮用量（E）為因素，進行L16（45）正交實驗，實驗設計見表1，在463nm下測定其吸光值，確定最佳工藝條件。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 類胡蘿卜素含量的測定 采用以下公式測定豐年蟲卵類胡蘿卜素的含量[11]：

式中，A為最大吸收波長463nm處的吸光值；V為提取所用有機試劑體積（m L）；W為提取物的質量（g）；2500為類胡蘿卜素的平均消光系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 破壁實驗

利用紫外可見分光光度計對提取液進行波長掃描，測得樣品在463nm處有最大吸收峰。圖1為在463nm下測定不同破壁方法破壁后豐年蟲卵中類胡蘿卜素的吸光值。由圖1可知，直接浸提和堿法破壁效果較差，而酶法破壁和二甲基亞砜，即DMSO破壁效果較好。由于DMSO本身較粘稠，且后期處理難以去除，故在后續(xù)研究中宜采用酶法進行破壁。

2.2 單因素實驗

2.2.1 木瓜蛋白酶pH對破壁效果的影響 經實驗可發(fā)現(xiàn)，當pH為8時，提取液顏色變淺，且樣液變得渾濁，無法測定其吸光值，故酶解pH應控制在酸性至中性范圍。由圖2可知，pH對提取效果有一定的影響。當pH在酸性條件下，提取效果較高，且隨著pH的增大，吸光值增大，當pH為6時，吸光值最大，即提取的類胡蘿卜素含量最高，破壁效果最好。當pH繼續(xù)增大時，效果反而下降。

圖1 不同破壁方法的破壁效果比較Fig.1 Comparison of different brokenmethods

圖2 木瓜蛋白酶pH對破壁效果的影響Fig.2 Effectof papain pH on the broken effect

2.2.2 溫度對破壁效果的影響 如圖3所示，在一定溫度范圍內，隨著酶解溫度的上升，吸光值逐漸增大，當溫度達到60℃時，吸光值最大，即提取得到的類胡蘿卜素含量最高，破壁效果最佳。而當溫度繼續(xù)上升，提取效果反而下降，這可能是由于溫度太高導致酶活性下降，同時也加速了類胡蘿卜素的氧化分解。

圖3 溫度對破壁效果的影響Fig.3 Effectof temperature on the broken effect

2.2.3 木瓜蛋白酶的用量對破壁效果的影響 如圖4所示，隨著木瓜蛋白酶用量的增加，吸光值逐漸增大，當木瓜蛋白酶用量達到225U/g時，吸光值最大，即提取的類胡蘿卜素含量最高，破壁效果最佳，而酶用量繼續(xù)增多，吸光值反而下降，提取的類胡蘿卜素含量減少。這可能是由于酶用量低于最佳值時，酶解未進行完全；達到最佳值時，酶解進行較完全；而繼續(xù)加大酶用量，底物濃度不能對酶達到飽和，導致酶的作用受到抑制。

圖4 木瓜蛋白酶的用量對破壁效果的影響Fig.4 Effectof papain dosage on the broken effect

2.2.4 破壁時間對破壁效果的影響 由圖5所示，隨著破壁時間的增加，吸光值呈逐步上升的趨勢，15min后上升趨勢較緩慢。在25m in時，吸光值最大，即提取得到的類胡蘿卜素含量最高，破壁效果最佳。但由于15～25m in這一階段，吸光值變化趨勢不明顯，從經濟角度考慮，選取破壁時間為15m in。大，在丙酮用量為40m L時，測得的吸光值最大，即提取得到的類胡蘿卜素含量最高，提取效果最佳。考慮到有機溶劑的耗用量及經濟因素，選取提取劑丙酮的最佳用量為40m L。

圖5 破壁時間對破壁效果的影響Fig.5 Effectof breaking time on the broken effect

2.2.5 丙酮用量對提取效果的影響 由圖6所示，隨著提取劑丙酮用量的增加，提取液的吸光值逐漸增

圖6 丙酮用量對提取效果的影響Fig.6 Effectof acetone dosage on the broken effect

2.3 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，以pH（A）、溫度（B）、酶用量（C）、破壁時間（D）、丙酮用量（E）為因素，進行了L16（45）正交實驗，結果分析見表2。

表2 正交實驗結果Table 2 Orthogonal test results

從表2的極差分析可知，對豐年蟲卵中類胡蘿卜素的提取效果的影響大小次序為D＞E＞B＞C＞A，即酶解時間對豐年蟲卵中類胡蘿卜素的提取效果影響最大，丙酮用量、酶解溫度、酶用量對提取效果影響次之，pH對提取效果影響最小。通過各因素綜合分析，酶法提取豐年蟲卵中類胡蘿卜素的最佳工藝參數(shù)為D3E3B4C4A3，即酶解時間25m in，提取劑丙酮用量30m L，酶解溫度60℃，酶用量375U/g，酶解pH6。

將對正交實驗得到的最佳工藝條件下的提取率與正交實驗組合中的最佳組A1B4C4D4E4的提取率進行比較，發(fā)現(xiàn)正交實驗得到的最佳工藝條件D4E3B4C4A3下的提取率更高，確定酶法提取豐年蟲卵中類胡蘿卜素的最佳工藝條件為調節(jié)木瓜蛋白酶pH至6，酶用量為375U/g，在60℃下酶解25min，再采用30m L/g的丙酮浸提。在此條件下，豐年蟲卵中類胡蘿卜素的提取率為0.03mg/g。

3 結論

采用木瓜蛋白酶對豐年蟲卵進行破壁。豐年蟲卵中類胡蘿卜素提取的最佳工藝條件為調節(jié)木瓜蛋白酶pH至6，酶用量為2.5%，在60℃下酶解25m in，再采用30m L/g的丙酮浸提。在此條件下，豐年蟲卵中類胡蘿卜素的提取率為0.03mg/g。

豐年蟲卵的細胞壁較硬，采用一般方法很難將其破碎，通過實驗表明，先采用酶法進行破壁，將其中的類胡蘿卜素釋放出來，然后再用有機溶劑浸提是一種非常有效的提取方法。

[1]張志軍，江曉路，牟海津，等.蛹蟲草類胡蘿卜素提取工藝的研究[J].食品科技，2007（4）：99-103.

[2]王清池，周時強，胡智兵，等.超聲波對豐年蟲卵孵化的影響[J].應用聲學，1999，18（6）：43-44.

[3]彭鑫華，張建新，聶路，等.堿性蛋白酶酶解豐年蟲卵蛋白工藝條件優(yōu)化[J].西北農業(yè)學報，2011，20（12）：197-202.

[4]Sofia Fredriksson，Klas Elwinger，Jana Pickova.Fatty acid and carotenoid composition of egg yolk as an effectofmicroalgae addition to feed formula for laying hens[J].Food Chemistry，2006，99：530-537.

[5]劉濤，黃保華，雷秋霞，等.影響禽蛋蛋黃著色的影響因素[J].家禽科學，2010（9）：44-46.

[6]郭鵬飛，胡長鷹.番木瓜中類胡蘿卜素的提取[J].中國調味品，2009（1）：95-99.

[7]倪輝，何國慶，吳光斌，等.酸法破壁條件對法夫酵母蝦青素提取效果的影響[J].農業(yè)工程學報，2005，21（3）：176-180.

[8]周錦珂，李金華，葛發(fā)歡，等.酶法提取雨生紅球藻中蝦青素的新工藝研究[J].中藥材，2008，31（9）：1423-1425.

[9]杜云建，陳卿.稀堿法提取蝦殼中蝦青素的工藝條件研究[J].食品與機械，2010，26（4）：112-114.

[10]張琇，李娜，曹曉虹，等.紅酵母蝦青素提取工藝的優(yōu)化[J].食品科技，2011，36（1）：196-199.

[11]王業(yè)勤，李勤生.天然類胡蘿卜素——研究進展、生產、應用[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1997：158-159.

Study on extraction process of carotenoids from artem ia cysts

WANG Tian-jiao，REN Dan-dan*，WANG Li，LIBai-lei，WANG Qiu-kuan，HE Yun-hai
（Key Laboratory ofAquatic ProductProcessingand Utilization of Liaoning Province，Collegeof Food Scienceand Engineering，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

The methods of papain b roken and organic solvent extraction were used for carotenoids extraction from artem ia cysts.Effec ts of sing le factors inc luding enzyme pH value，temperature，enzyme add ition，enzyme time and solvent for the extraction were investigated by sing le factor and orthogonal test.The results showed that the op timalcond itions of extraction were as follow ing：ad justing the papain pH to 6，adding enzyme 375U/g，enzymolysis 25m in under60℃，using acetone of30m L/g.Under these conditions，the extrac tion rate ofcarotenoids extracted from artem ia cysts was 0.03mg/g.

artem ia cysts；carotenoids；extraction

TS254.1

B

1002-0306（2014）18-0298-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.058

2014－01－03 *通訊聯(lián)系人

王添嬌（1990-），女，碩士研究生，研究方向：海洋生物資源利用。