浸漬式快速冷凍液的優化及凍結技術對脆肉鯇品質的影響

馬曉斌，林婉玲，楊賢慶，*，刁石強，郝淑賢，馬海霞

（1．廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088；2．中國水產科學研究院南海水產研究所，國家水產品加工技術研發中心，農業部水產品加工重點實驗室，廣東廣州510300）

浸漬式快速冷凍液的優化及凍結技術對脆肉鯇品質的影響

馬曉斌1，2，林婉玲2，楊賢慶2，*，刁石強2，郝淑賢2，馬海霞2

（1．廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088；2．中國水產科學研究院南海水產研究所，國家水產品加工技術研發中心，農業部水產品加工重點實驗室，廣東廣州510300）

為優化浸漬快速凍結的冷凍液配方，以乙醇、丙二醇、甜菜堿和氯化鈉組成冷凍液，運用Box-Behnken實驗設計原理進行實驗設計，探討冷凍液的最佳配比。并用此最佳冷凍液（-35℃）對脆肉鯇進行研究，比較-18℃凍結、直接浸漬凍結、間接浸漬凍結對脆肉鯇品質的影響。結果表明：以占冷凍液總質量分數計，由20%乙醇、10%丙二醇、7%甜菜堿和10%氯化鈉和水組成的冷凍液，凍結點可達-66.10℃。采用-18℃凍結的樣品與兩種浸漬凍結的樣品相比較，前者肌原纖維蛋白含量和總巰基含量低于后者，并且Ca2+-ATPase活性的損失高于后者。綜合各項指標說明浸漬凍結利于減少蛋白的變性。

冷凍液，響應面法，脆肉鯇，凍結特性

浸漬凍結技術是利用低溫的冷凍液與物品直接接觸，在物品浸入液體后瞬間表層凍結，從而實現快速冷凍，是一種凍結速率快、低能耗加工技術[1-4]。直接浸漬凍結中的冷凍液與物品接觸，對冷凍液的質量要求相對較高。浸漬凍結中所用的載冷劑包括醇類、糖類和鹽類的水溶液等[2，5]。楊賢慶等[6]以甜菜堿、丙二醇、氯化鈉與水組成的冷凍液，其凍結點偏高和黏度偏大，為了得到凍結點更低和黏度更小的冷凍液，所以需要對冷凍液進一步的優化。

脆肉鯇（Ctenopharyngodon idellus）的蛋白質含量比普通鯇魚（草魚）高，肉質緊密，肉味鮮美和久煮不爛。目前脆肉鯇主要以鮮活的方式進行運輸和銷售，很少對脆肉鯇進行加工，但隨著脆肉鯇的產量及市場需求的日益增加，急需進行其他產品形式的深加工技術研究。冷凍魚片是魚類冷凍加工的主要產品形式之一，主要是采用空氣鼓風凍結和間接凍結，阮征[7]和李汴生等[8]研究不同凍結速率和凍結溫度對脆肉鯇品質的影響，指出提高凍結速率有利于保持脆肉鯇的品質。因此，尋找一種適合脆肉鯇加工的快速凍結工藝是擴大脆肉鯇加工的一種重要手段之一。鄧敏等[9-10]研究了不同凍結方式和不同浸漬凍結溫度對草魚品質的影響，指出浸漬凍結優于常規空氣鼓風凍結。但是，浸漬凍結技術對脆肉鯇品質研究鮮有報道。

因此，本實驗在前期配方的基礎上，通過采用響應面分析實驗對浸漬凍結的冷凍液配方進行優化，得出最佳配比，然后用最佳配方研究浸漬快速凍結技術對脆肉鯇品質的影響，為脆肉鯇的保鮮加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脆肉鯇 廣東省中山市坦洲鎮某養殖場；蛋白定量（雙縮脲法）試劑盒、Ca2+-ATP酶測試盒 江蘇南京建成生物工程研究所；1-苯胺基-8-萘基磺酸（ANS）、DTNB 美國Sigma公司；其余試劑 均為分析純。

DW-86L386海爾超低溫冰箱 青島海爾股份有限公司；735-2溫度測量儀 德國德圖儀器公司；TES 1310溫度計探頭 臺灣泰仕電子工業股份有限公司；NDJ-8s數字黏度計 上海方瑞儀器有限公司；MettlerGB204電子天平 梅托勒-托利多儀器公司；SP 2558熒光光度計；UV-3000（PC） 紫外可見分光光度計；Sigma-3K30高速冷凍離心機 美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 冷凍液凍結點的測定 參照楊賢慶等[6]方法進行測定。

1.2.2 冷凍液黏度的測定 參照楊賢慶等[6]方法，并稍作修改。為了準確的測定某一溫度下的黏度值，在待測冷凍液外加無水乙醇，即將盛有冷凍液的燒杯置于無水乙醇大燒杯中。

1.2.3 Box-Behnken實驗設計 在楊賢慶等[6]研究的基礎上，主要研究乙醇（A）質量分數（10%～20%）、丙二醇（B）質量分數（2%～10%）、甜菜堿（C）（5%～ 15%）、氯化鈉（D）質量分數（2%～10%）對凍結點和黏度的影響。采用響應面設計，運用Design-Expert 8.0數據分析軟件進行Box-Behnken實驗設計原理，以凍結點的絕對值與-20℃的黏度的比值為響應值，比值越大，冷凍液質量越好。設計四因素三水平的響應面分析實驗，實驗分析水平見表1。

表1 浸漬速凍冷凍液響應面實驗因素水平表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.2.4 凍結和解凍 將脆肉鯇魚片（以背部肉為主）均分為三組，分別做如下處理：

a.第一組直接置于-18℃冰箱凍結，當中心溫度至-18℃時，用濾紙吸干樣品表面殘留的液體，密封于聚乙烯塑料袋中，在4℃下解凍備用；

b.第二組直接浸漬在優化后的冷凍液（-35℃）中凍結（直接浸漬凍結），凍結至中心溫度為-18℃，用濾紙吸干樣品表面殘留的液體，密封于聚乙烯塑料袋中，在4℃下解凍備用；

c.第三組采用聚乙烯塑料袋真空包裝后間接浸漬在優化后的冷凍液（-35℃）中凍結（間接浸漬凍結），當魚片中心溫度降至-18℃時，用濾紙吸干樣品表面殘留的液體，放置于4℃冰箱中解凍備用。

1.2.5 肌原纖維蛋白的提取 按照GB/T 18654.10-2002[11]進行取樣，參照Hashimoto等[12]的方法進行提取。

1.2.6 蛋白含量的測定 采用蛋白定量（雙縮脲法）試劑盒測定。

1.2.7 Ca2+-ATPase酶的活性測定 采用定磷法測定，使用Ca2+-ATP酶測試盒測定。

1.2.8 總巰基含量的測定 根據Ellman和Benjakul等方法，運用DTNB法[13-14]測定。

1.2.9 表面疏水性的測定 在Benjakul等[14]方法上稍作修改，激發波長366nm，發射波長470nm。

1.3 數據處理和統計分析

黏度值采用10次平行實驗的均值，其余數據均為3次平行實驗的均值，數據用均值±標準差表示。數據統計采用JMP7.0（SAS公司）和Excel 2003（微軟公司）處理，蛋白質冷凍變性的變化運用ANOVA單因素方差分析及Tukey’s HSD法多重檢驗（p＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 響應面分析與實驗結果

響應面分析實驗[14-15]結果見表2，回歸方程方差分析見表3。

經回歸擬合后，實驗因子對響應值的影響可以用回歸方程表示為：

從表3可得整體模型的顯著性水平p＜0.0001，說明所選用的二次多項式模型具有顯著性，能夠很好的反應各因素與響應值之間的關系，可以運用該回歸方程確定最佳冷凍液的配方。失擬性檢驗p= 0.1851＞0.05，表明差異不顯著，說明殘差有隨機誤差引起。R2=0.9374，表明曲線的擬合程度較高。由表3的方差分析可以看出，A、B、C、D、AC、A2為顯著性影響因素。影響因素的顯著性次序為丙二醇＞乙醇＞氯化鈉＞甜菜堿。

2.2 配方的響應曲面分析與優化

從表3可知，只有AC響應值的變化具有顯著性的影響，于是列出了乙醇和甜菜堿對冷凍液質量影響的響應面圖，其余均未列出。

表2 響應面分析實驗結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

圖1 乙醇和甜菜堿質量分數對冷凍液質量的影響響應面圖Fig.1 Response surface plots showing the interactive effects of ethanol and betaine concentration on the freezing pointof immersion solution

由圖1可知，乙醇對響應值的影響較甜菜堿顯著，當乙醇質量分數為20%時，隨甜菜堿的含量增加，響應值變化較小，這可能與甜菜堿具有較大的黏度有關。

通過回歸方程求解得到最大值，得到冷凍液最佳配方是20.00%乙醇、10.00%丙二醇、7.00%甜菜堿和10.00%氯化鈉，由模型方程預測得到的響應值是1.20。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regressionmodel

根據響應面優化的結果，以20%乙醇、10%丙二醇、7%甜菜堿和10%氯化鈉為配方，進行驗證實驗，響應值為1.18±0.02，凍結點為（-66.11±0.056）℃，-20℃黏度為（55.73±1.18）mPa·s，且-35℃黏度為（154.26± 1.81）mPa·s，該配方比楊賢慶等[6]研究的凍結點低，黏度較小，質量好。可能是由于乙醇的加入，與其他幾種物質相互作用，有助于其凍結點和黏度的降低。根據單樣本t檢驗，與模型方程預測值無顯著性差異（p＞0.05），表明實際測的值與模型方程預測一致。

2.3 凍結曲線

圖2 不同凍結方式的凍結曲線Fig.2 Freezing curve under different freezing processing conditions

圖2為脆肉鯇塊分別在3種不同凍結方式下的凍結曲線。從圖2可知，浸漬凍結通過最大冰晶生成帶（凍結點）的時間少于-18℃凍結。-18℃、直接浸漬和間接浸漬凍結至魚塊中心溫度-18℃分別需要6.3、0.38、0.43h，可知直接浸漬和間接浸漬凍結的速率大于-18℃凍結，直截浸漬凍結的速率和間接浸漬凍結速率差不大。Jeremiah研究指出凍結速率快，形成的冰晶體積小，數量多，分布均勻，對組織細胞的破壞作用小，可以較好的保持食品的品質[16]。

2.4 凍結前后蛋白質冷凍變性的變化

2.4.1 肌原纖維蛋白含量的變化 魚肉在凍結過程中，肌原纖維蛋白發生變性導致其鹽溶性發生變化，鹽溶性蛋白的含量減少[18]。通常魚肉蛋白的冷凍變性越嚴重，其鹽溶性蛋白的含量越低。從表4可以看出，與新鮮魚塊相比，凍結后樣品的肌原纖維蛋白含量的溶出量有不同程度的降低，直接浸漬和間接浸漬凍結下降的程度比-18℃凍結的小。由圖2可知，直接浸漬和間接浸漬凍結速率快，快速的通過最大冰晶生長帶，在凍結的魚肉形成的冰晶細小且均勻，對肌肉組織破壞較小，因此直接浸漬和間接浸漬凍結對蛋白質變性程度較小，提取的肌原纖維含量相對-18℃凍結的高。

2.4.2 Ca2+-ATPase酶的活性的變化 Ca2+-ATP酶活性來源于肌球蛋白，表征其頭部S-1片段的性質，是衡量蛋白質冷凍變性的重要指標[19]。凍結前后樣品的Ca2+-ATP酶活都有不同程度的降低，Ca2+-ATP酶活性降低程度分別經直接浸漬和間接浸漬凍結的樣品其蛋白變性的程度比經-18℃凍結小。經-18℃凍結Ca2+-ATP酶活性下降程度最大，說明凍結速率慢，通過最大冰晶生長帶時間長，肌球蛋白的完整性易破壞，蛋白容易發生變性。而經直接浸漬和間接浸漬的樣品凍結速率快，有助于快速通過最大冰結晶生成區，從而可以減緩脆肉鯇蛋白的冷凍變性。

2.4.3 總巰基含量的變化 巰基是魚肉蛋白中最具有反應活性基團，巰基對于穩定肌原纖維蛋白空間結構具有主要的意義。巰基含量的變化反映蛋白的變性程度[20]。由表4可知，經-18℃凍結處理后的總巰基含量顯著下降，而經過直接浸漬和間接浸漬凍結處理后的幾乎沒有下降。因此可推測出，-18℃凍結速率慢，形成了較大和較多的冰晶，很大程度上破壞了蛋白的結構，埋藏在其分子內部的巰基更加容易暴露，易氧化而形成二硫鍵，從而總巰基含量下降。

2.4.4 表面疏水性的變化 蛋白質的表面疏水性反映的是蛋白質分子表面疏水性氨基酸的相對含量，也可以用它來衡量蛋白質的變性程度[21]。表4可以看出經過不同凍結方式的處理后，表面疏水性都顯著增加，直接浸漬和間接浸漬凍結的增加量比-18℃凍結的少。在凍結的過程中蛋白質表面疏水性的增加是由于蛋白質的伸展和疏水性脂肪族及芳香族氨基酸的暴露，破壞了蛋白質原來的空間構象，從而蛋白質表面疏水性增加[22]。

3 結論

3.1 利用Box-Behnken實驗設計和響應面分析法，探討浸漬快速凍結的凍結液配方的最佳配比為：以占冷凍液總質量分數計，20%乙醇、10%丙二醇、7%甜菜堿和10%氯化鈉。此條件下的冷凍液的凍結點可達-66.10℃。

3.2 并運用此最佳冷凍液（-35℃）進行研究，采用-18℃凍結、直接浸漬凍結和間接浸漬凍結的樣品，凍結后肌原纖維蛋白含量、Ca2+-ATPase活性的損失和總巰基含量都有不同程度的降低，而直截浸漬凍結和間接浸漬凍結降低的幅度小。綜合各指標，可以得出經快速浸漬凍結對脆肉鯇的品質優于-18℃凍結。

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表4 凍結前后蛋白質冷凍變性的變化Table 4 Change in protein frozen denaturation after freezing

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Optim ization of immersion solution for quick freezing and the effect of freezing technology on the quality characteristics of crisp grass carp

MA Xiao-bin1，2，LINW an-ling2，YANG Xian-qing2，*，DIAO Shi-qiang2，HAO Shu-xian2，MA Hai-xia2
（1.College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，National Research and Development Center for Aquatic Product Processing，Key Laboratory of Aquatic Product Processing，Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China）

An immersion solution for quick freezing was using ethanol，p ropaned iol，betaine and sodium chloride. A Box-Behnken experimental design was used to exp lore op timal immersion solution formulation.The op timal immersion solution was used to study on crisp g rass carp，com pared the influence of immersion and chilling freezing and trad itional-18℃ on the quality changes of crisp g rass carp.A freezing point of-66.10℃ was observed for an aqueous immersion solution containing，on a total d ipp ing solution weight basis，20%ethanol，10%p ropaned iol，7%betaine and 10%sodium chloride，respectively.Com pared w ith the other two freezing p rocessing，crisp grass carp frozen in-18℃had lower contentofm yofibrillar p rotein and total-SH，more reduced Ca2+-ATPase activity.The results of physicochem ical and textural charac teristics ind icated that immersion and chilling freezing could assist to reduce the denaturation of fish p rotein.

immersion solution；response surfacemethodology；crisp g rass carp；freezing characteristics

TS254.4

A

1002-0306（2014）18-0338-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.067

2013－12－31 *通訊聯系人

馬曉斌（1988-），男，碩士研究生，主要從事水產品加工與貯藏方面的研究。

國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B00）；農業部水產品加工重點實驗室項目（nybjg201202）。