鈣敏感受體對巨噬細胞泡沫化過程的影響及機制研究*

于曉東，李瑩，張鳳香

鈣敏感受體對巨噬細胞泡沫化過程的影響及機制研究*

于曉東，李瑩，張鳳香

目的：研究鈣敏感受體（CaR）在巨噬細胞中的表達情況及對巨噬細胞轉化為泡沫細胞的影響。

鈣敏感受體；巨噬細胞 ；CD36；膽固醇酰基轉移酶

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:828.)

動脈粥樣硬化（AS）是由多種因素作用產生的復雜的病理變化，其中巨噬細胞的泡沫化轉變在AS的發生和發展過程中起到了十分重要的作用。因此，如何抑制巨噬細胞轉變為泡沫細胞已經成為了近些年研究的重點。鈣敏感受體（calcium-sensing receptor, CaR）是G蛋白偶聯受體超家族中C家族的一員，它廣泛存在于冠狀動脈、腎動脈和主動脈等心血管系統中，并與AS的形成和發展有密切聯系[1]。但CaR在巨噬細胞中是否存在表達，以及CaR對巨噬細胞的泡沫化過程是否能產生影響尚知甚少。本實驗主要探討CaR在巨噬中的表達情況，以及對巨噬細胞向泡沫細胞轉變的影響。

1 材料和方法

材料：2013-03至2013-09人巨噬細胞（中國科學院上海生物研究所細胞庫）；CaR激動劑（GdCl3） 、CaR 抑制劑（NPS2390，上海生工公司）；氧化低密度脂蛋白（oxLDL，北京生物技術公司）；DMEM胎牛血清（美國 Hyclone 公司）；兔抗鼠CaR抗體、兔抗鼠膽固醇酰基轉移酶（ACAT-1）單克隆抗體、兔抗鼠CD36單克隆抗體、小鼠抗β-肌動蛋白（β-actin ）單克隆抗體 、HRP 標記山羊抗小鼠二抗（北京中杉金橋公司）；免疫熒光染色試劑盒-FITC（美國Santa Cruz公司）；酶聯免疫吸附法（ELISA，試劑盒為美國ADL 公司）。

細胞培養、泡沫化處理及分組：人巨噬細胞置于 37℃水浴中 1 min 內快速復蘇，細胞在含20% 胎牛血清的DMEM培養液中培養, 置于37℃、5% CO2 孵箱中，每隔 3～5 天傳代一次，細胞密度為1×106個/ml。取對數生長期的細胞，加入100 mg/L ox-LDL培養48 h，誘導泡沫細胞形成。將誘導的泡沫細胞分為3組（各組n=6）：空白對照組；CaR激動劑（GdCl3）組；CaR抑制劑（NPS2390）組。空白對照組只加培養基，而CaR激動劑組和CaR抑制劑組分別加入GdCl3和NPS2390，然后連續培養48 h后，收集各組泡沫細胞備后續實驗。

免疫熒光染色檢測CaR蛋白的定位表達：巨噬細胞在經4%多聚賴氨酸預處理的蓋玻片上培養，用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗（NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，KH2PO40.24 g，Na2HPO43.628 g，溶于800 ml蒸餾水中， pH=7.4），4%的甲醛固定30 min，山羊血清37℃下，封閉30 min；CaR抗體孵育，4℃過夜；PBS沖洗3次；FITC-標記的抗鼠IgG孵育，37℃1 h; 4，6-聯脒-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，2-（4-amidinophenyl）-1H -indole-6-carboxamidine，DAPI）染核，PBS沖洗3次，熒光顯微鏡下觀察。

油紅 O 染色：細胞培養于預先放有無菌蓋玻片的6孔培養板，待處理好后，用PBS洗3次，60%異丙醇固定1 min，PBS洗1次，油紅O染色細胞10 min，PBS洗3 次，每次1 min，蘇木素復染2 min，1%鹽酸酒精分色1 s，水性封片劑封片。光學顯微鏡下觀察細胞內脂滴[2]。

高效液相色譜（HPLC）分析：用0.9% NaCl離心洗滌2遍，棄上清，加0.9% NaCl 500 μl重懸細胞，冰浴中超聲裂解細胞。4℃，15000 g/min，離心10 min，進行蛋白定量。余下上清加入150 μl內標液，渦旋混勻。將混合物分成等量的兩份，加入等體積的新鮮配制的15% KOH醇溶液，50℃水浴2 h。然后加正己烷，振蕩器上渦旋混勻。取上層有機相在真空干燥機中真空干燥。沉淀中加入丙酮和CrO3。正己烷終止反應，加水混勻，取上層有機相300 μl放于真空干燥機中真空干燥。加入100 μl異丙醇：正庚烷：乙腈（35：12：52，v/v） 將樣本溶解，活性碳去色素；超聲除氣，1500 g/min離心 5 min，收集上清液；取10 μl進樣，進行HPLC分析[2,3]。

ELISA 檢測：取出實驗所需板條，留空白孔。加0.1 ml離心后的細胞培養上清液于反應孔中，置37℃孵育90 min，然后洗板5次。于各反應孔中，加入新鮮稀釋的生物素化抗體工作液0.1 ml，37℃孵育1 h，洗板5次。加酶結合工作液0.1 ml，37℃避光孵育30 min，洗板5次。加入0.1 ml顯色底物液，37℃避光孵育15 min：于各反應孔中加入終止液0.1 ml，混勻后即可測量光密度（OD）450值。

蛋白印跡（Western blot） 檢測： 泡沫細胞收集后用PBS洗2次，裂解緩沖液[20 mmol/ L Tris-HCl、pH 7.4，150 mmol/L NaCl、1% Triton x-100、0.1% 十二烷基磺酸鈉（SDS）、1%脫氧膽酸鈉、1 mmol/L 依地酸二鈉（EDTA）、1 mmol/L PMSF、1 μg/ml aprotinin、1 mmol/L Na3VO4 ]提取細胞總蛋白，BCA試劑盒定量。煮沸變性，每孔加40 μg樣本，濃縮膠6%，分離膠10% SDS-PAGE電泳分離，恒壓電轉移至硝酸纖維素膜, 5%脫脂牛奶封閉1 h。兔抗鼠CaSR（1:3000）、兔抗鼠CD36（1:500）、兔抗鼠ACAT-1（1:1000），4℃過夜。反復洗膜，后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗 IgG 抗體（ 1:1000）孵育，4℃孵育2 h。洗膜3次，每次10 min。ECL發光試劑盒發光顯影，凝膠成像。

統計學方法：采用SPSS 13.0 for windows統計軟件進行處理。數據以均數±標準差表示，各組數據進行正態性和方差齊性檢驗，兩樣本的均數比較采用t檢驗，以 P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

巨噬細胞中CaR的表達情況： Western blot結果顯示，加入CaR抗體的巨噬細胞可見明顯條帶出現，而未加入CaR抗體的的巨噬細胞未見任何條帶（圖1A）。免疫熒光結果顯示，未加入CaR抗體的巨噬細胞僅見核藍染（圖1B）；而加入CaR抗體的巨噬細胞的胞膜與胞漿內均有特異性綠色熒光，DAPI將核染為藍色。以上結果說明CaR在巨噬細胞中存在表達。圖1B、1C

圖1 蛋白印跡和免疫熒光法檢測巨噬細胞中CaR的表達情況

高效液相色譜（HPLC）分析各組泡沫細胞膽固醇代謝結果：各組作用細胞48 h后，油紅O染色結果顯示：空白對照組細胞油紅O染色陽性率為（54.12±4.23）%； CaR激動劑組細胞油紅O染色陽性率為（21.97±2.04）%； CaR抑制劑組細胞油紅O染色陽性率為（87.69±6.67）%。HPLC結果顯示：CaR抑制劑組的膽固醇酯、游離膽固醇、總膽固醇、膽固醇酯/總膽固醇值顯著高于空白對照組，而CaR激動劑組的膽固醇酯、游離膽固醇、總膽固醇、膽固醇酯/總膽固醇值顯著低于空白對照組，差異均有統計學意義 （P＜0. 05） 。表1

表1 高效液相色譜分析各組泡沫細胞膽固醇代謝結果(mg/g, n=6,

表1 高效液相色譜分析各組泡沫細胞膽固醇代謝結果(mg/g, n=6,

注：與空白對照組比較*P＜0.05 。CaR：鈣敏感受體

分組 膽固醇酯 游離膽固醇 總膽固醇 膽固醇酯/總膽固醇(%)空白對照組 56.27±5.16 41.96±3.88 72.64±7.42 77.62±6.12 CaR激動劑組 11.02±2.14* 14.36±2.51*26.57±3.62* 41.56±2.67*CaR抑制劑組 81.34±5.97* 59.23±4.16*98.42±9.65*88.81±7.23*

CaR對泡沫細胞上清液中炎性因子分泌的影響：各組作用細胞48 h后，ELISA檢測結果顯示：與空白對照組比較， CaR激動劑組腫瘤壞死因子-a（TNF-α） 和巨噬細胞游走抑制因子（MIF）水平明顯降低，而白介素-10（ IL-10）水平明顯升高 （P＜0.05）； CaR抑制劑組 TNF-α和 MIF水平明顯升高，而IL-10水平明顯降低 （P＜0.05），差異均有統計學意義。表2

表2 CaR對泡沫細胞上清液中炎性因子分泌和CD36、ACAT-1蛋白表達的影響(mg/g, n=6,

表2 CaR對泡沫細胞上清液中炎性因子分泌和CD36、ACAT-1蛋白表達的影響(mg/g, n=6,

注：與空白對照組比較*P＜0.05。ACAT-1膽固醇酰基轉移酶。余注見表1

指標 空白對照組 CaR激動劑組 CaR抑制劑組炎性因子腫瘤壞死因子-α 61.31±4.28 43.67±3.76* 79.64±5.03*巨噬細胞游走抑制因子 53.67±4.96 35.21±3.43* 71.44±5.32*白細胞介素-10 56.25±4.66 72.31±4.78* 40.63±4.01*CD36 0.32±0.02 0.21±0.02* 0.49±0.03*ACAT-1 0.59±0.04 0.41±0.03* 0.73±0.04*

CaR對泡沫細胞中CD36和ACAT-1蛋白表達的影響 ：各組作用細胞48 h后，Western blot檢測結果顯示：與空白對照組比較， CaR激動劑組CD36和ACAT-1蛋白表達明顯降低，而CaR抑制劑組CD36和ACAT-1蛋白表達明顯升高（P＜0.05），差異均有統計學意義。表2、圖2

圖2 蛋白印跡檢測巨噬細胞中CD36和ACAT-1蛋白的表達

3 討論

泡沫細胞是由單核巨噬細胞吞噬大量脂質后得以形成的，它是AS的顯著特征。泡沫細胞可以通過大量釋放游離膽固醇和膽固醇酯，并使其聚集在血管壁的損傷處，從而形成AS斑塊的脂質核心。泡沫細胞還可以通過分泌細胞因子、趨化因子和蛋白酶等炎癥介質，促進斑塊局部發生炎癥反應，降低斑塊穩定性，引起斑塊破裂和脫落，最終導致缺血性心血管疾病的形成[4]。

本研究通過Western blot檢測發現在巨噬細胞內CaR抗體組出現170 kD特異性條帶，而陰性對照組無任何條帶出現。免疫熒光染色顯示，CaR蛋白定位在巨噬細胞的胞膜和胞漿。以上結果說明巨噬細胞內有CaR的表達。研究表明CaR在AS的形成和發展中起重要作用。因此，本實驗進一步研究CaR對巨噬細胞泡沫化的影響。本研究發現；與空白對照組比較，CaR激動劑組的細胞陽性率和總膽固醇、游離膽固醇、膽固醇酯值均明顯降低，而CaR抑制劑組的細胞陽性率和總膽固醇、游離膽固醇、膽固醇酯值均明顯升高。該結果說明當CaR的表達增強時巨噬細胞向泡沫細胞的轉化被明顯抑制。TNF-α可以通過損傷內皮細胞、促進凝血和抑制纖溶等作用來促進AS的形成[5,6]。MIF可以通過抑制巨噬細胞的游走和促進巨噬細胞在炎性反應區域的聚集、增生和分 泌細 胞 因 子等作用來促進AS的形成[7]。而 IL-10則可以通過抑制單核巨噬細胞合成及釋放各種炎性因子和抑制炎性細胞的黏附、浸潤等作用來抑制AS的形成[8]。本研究發現，與空白對照組比較，CaR激動劑組TNF-α和MIF 水平明顯降低，而IL-10水平明顯升高；CaR抑制劑組TNF-α和MIF水平明顯升高，而 IL-10水平明顯降低。該研究結果說明， 高表達的CaR具有促進抗炎因子分泌和抑制促炎因子分泌的作用。CD36是單核巨噬細胞表面的一種清道夫受體，巨噬細胞可以通過CD36攝取大量ox-LDL形成泡沫細胞，進而影響AS的形成[9-11]。ACAT-1可以使細胞內游離膽固醇轉變為膽固醇酯，而大量蓄積的膽固醇酯則可以使巨噬細胞轉變為泡沫細胞[12]。本研究結果顯示，與空白對照組比較，CaR激動劑組CD36和ACAT-1蛋白表達明顯降低，而CaR抑制劑組CD36和ACAT-1蛋白表達明顯升高。該研究結果說明，高表達的CaR可以通過下調泡沫細胞形成基因CD36和ACAT-1蛋白表達來抑制巨噬細胞內脂質的蓄積。

綜上,巨噬細胞中存在CaR的表達，并且CaR的表達變化可以影響巨噬細胞泡沫化的形成，但其具體機制還需做進一步的研究。

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Effect of Calcium-sensing Receptor on Human Macrophages Converting to Foam Cells With its Mechanisms

YU Xiao-dong, LI Ying, ZHANG Feng-xiang.
Department of Cardiac Surgery, First Aff i liated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou (121001), Liaoning, China

ZHANG Feng-xiang, Email: zhangfengxiang64@163.com

Objective: To study the expression of calcium-sensing receptor (CaR) in human macrophages and the effect of CaR on macrophages converting to foam cells with its mechanism.Methods: Human macrophages were treated with ox-LDL (100 mg/L) for 48 h to induce foam cell formation, the experimental foam cells were cultured in 3 groups for 48 h respectively. Blank control group, Foam cell + CaR agonists (Agonists) group and Foam cell + CaR inhibitor (Inhibitor) group. The CaR expression in macrophages was measured by immuno-fluorescence and Western blot analysis. The positive foam cell formation was detected by oil red O staining, the intracellular cholesterol metabolism in foam cell was observed by HPLC, the inf l ammatory cytokine secretion in foam cell culture supernatant was examined by ELISA, the protein expressions of CD36 and acyl-coA: cholesterol acyl-transferase (ACAT-1) in foam cells was measured by Western blot analysis.Results: Immuno-f l uorescence and Western blot indicated CaR is expressed in human macrophages. Compared with Control group, Oil Red O staining and HPLC showed that Agonists group had less positive foam cell formation, decreased CE, FC , TC, and Inhibitor group had more positive foam cell formation, increased CE, FC, TC, all P＜0.05; ELISA presented that Agonists group had decreased TNF-α, MIF, increased anti-inflammatory cytokine IL-10, and Inhibitor group had increased TNF-α, MIF, decreased IL-10, all P＜0.05; Western blot analysis indicated that Agonists group had decreased protein expressions of CD36, ACAT-1in foam cells, and Inhibitor group had increased protein expressions of CD36 and ACAT-1.Conclusion: CaR is expressed in human macrophages, the higher CaR expression may inhibit macrophages converting to foam cells.

Calcium-sensing receptor; Macrophages; CD36; Acyl coA: cholesterol acyl-transferase

2014-01-16)

（編輯：梅平）

遼寧省自然科學基金（2013022010）；遼寧醫學院青年科技啟動基金項目 (XZJJ20130246) ；遼寧醫學院附屬第一醫院青年科技啟動基金項目 (FY2012-07)

121001 遼寧省錦州市，遼寧醫學院附屬第一醫院 心外科

于曉東 碩士研究生 主要從事動脈粥樣硬化研究 Email: canghaiguanri@126.com 通訊作者：張鳳香 Email: zhangfengxiang64@163.com

R541

A

1000-3614（2014）10-0828-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.10.017

方法: 通過免疫熒光和蛋白印跡（Western Blot）檢測巨噬細胞中CaR的表達情況；氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）100 mg/L作用48 h，使巨噬細胞轉化為泡沫細胞；實驗分組為CaR激動劑組、CaR抑制劑組、空白對照組，分別作用泡沫細胞48 h：采用油紅O染色檢測陽性細胞數量；高效液相色譜觀察細胞內膽固醇代謝情況；酶聯免疫吸附法（ ELISA）檢測細胞上清液中炎性因子的分泌情況；Western blot檢測細胞內CD36和膽固醇酰基轉移酶（ACAT-1）蛋白的表達情況。

結果: Western blot和免疫熒光結果顯示在巨噬細胞中存在CaR的表達。油紅O染色和高效液相色譜檢測泡沫細胞的結果顯示：與空白對照組比較，CaR激動劑組陽性細胞數量和膽固醇酯、游離膽固醇、總膽固醇的含量均明顯下降（P＜0.05），而CaR抑制劑組陽性細胞數量和膽固醇酯、游離膽固醇、總膽固醇的含量均明顯升高（P＜0.05）；ELISA 檢測結果顯示：與空白對照組比較，CaR激動劑組促炎因子腫瘤壞死因子-（TNF- a）、巨噬細胞游走抑制因子（MIF）含量明顯降低（P＜0.05），抗炎因子白細胞介素-10（IL-10） 含量明顯升高（P＜0.05），而CaR抑制劑組促炎因子TNF- a、 MIF 含量明顯升高（P＜0.05），抗炎因子IL-10含量明顯降低（P＜0.05）；Western blot檢測各組泡沫細胞結果發現：與空白對照組比較，CaR激動劑組CD36和ACAT-1蛋白表達明顯下降，而CaR抑制劑組CD36和ACAT-1蛋白表達明顯升高。

結論: 在巨噬細胞中存在CaR的表達，并且高表達的CaR可以抑制巨噬細胞泡沫化的形成。