呈味核苷酸含量基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究

李 涵， 高運(yùn)華， 吳 迪， 李倩琪， 楊 屹

（1.北京化工大學(xué)，北京 100029；2.中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013）

呈味核苷酸含量基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究

李 涵1， 高運(yùn)華2， 吳 迪1， 李倩琪1， 楊 屹1

（1.北京化工大學(xué)，北京 100029；2.中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013）

以市售雞精為基體，研制呈味核苷酸含量基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。優(yōu)化雞精中核苷酸提取條件，建立有機(jī)溶劑法提取核苷酸的技術(shù)手段。以核苷酸國家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)，采用高效液相色譜外標(biāo)法、離子色譜外標(biāo)法兩種技術(shù)對(duì)雞精基體中呈味核苷酸特性量值進(jìn)行確定，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性，結(jié)果表明其均勻性良好，且一年內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值沒有顯著差異。同時(shí)建立基于離子色譜和高效液相色譜兩種外標(biāo)法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值進(jìn)行確定的不確定度評(píng)定模型，對(duì)研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行不確定度評(píng)定，為復(fù)雜基體中核苷酸含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供了借鑒，為呈味核苷酸檢測的相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)制定提供技術(shù)參考。

雞精；基體；呈味核苷酸；含量；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；不確定度評(píng)定

0 引 言

5′-肌苷酸二鈉（inosine 5′-monophosphate，IMP）和5′-鳥苷酸二鈉（guamosine 5′-monophosphate，GMP）具有呈味性，與谷氨酸鈉具有協(xié)同效應(yīng)，可提高鮮味數(shù)十倍，在調(diào)味品和食品中應(yīng)用廣泛[1]。呈味核苷酸和谷氨酸鈉是反映雞精調(diào)味料質(zhì)量的主要指標(biāo)，SB/T 10371—2003《雞精調(diào)味料》規(guī)定，雞精調(diào)味料中呈味核苷酸二鈉不得低于1.10g/100g，谷氨酸鈉不得低于35.0g/100g。但2008年國家質(zhì)檢總局調(diào)味品抽查結(jié)果顯示，個(gè)別雞精調(diào)味產(chǎn)品中呈味核苷酸二鈉為0.35g/100g，谷氨酸鈉為14.8g/100g，未達(dá)到要求。浙江省工商局對(duì)流通領(lǐng)域銷售的調(diào)味品開展的質(zhì)量專項(xiàng)檢測也發(fā)現(xiàn)，雞精、味精等調(diào)味品的關(guān)鍵成分谷氨酸鈉、呈味核苷酸明顯不足[2-4]。此外，谷氨酸鈉和呈味核苷酸都屬于雞精最關(guān)鍵的質(zhì)量指標(biāo)，可部分企業(yè)并未將其列入標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目內(nèi)。文獻(xiàn)表明，我國現(xiàn)行的核苷酸檢測標(biāo)準(zhǔn)QB/T 2845—2007《食品添加劑呈味核苷酸二鈉》、SB/T 10371—2003《雞精調(diào)味料》、SB/T 10415—2007《雞粉調(diào)味料》等均為企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，國家級(jí)檢測標(biāo)準(zhǔn)仍為空白，這限制了國家對(duì)調(diào)味品中呈味核苷酸的技術(shù)檢驗(yàn)[5]。本文以市售雞精為基體，研制呈味核苷酸含量基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：Agilent1200，包括四元低壓梯度輸液泵、二極管陣列檢測器、在線脫氣和柱溫控制系統(tǒng)、自動(dòng)進(jìn)樣器、儀器控制和數(shù)據(jù)處理工作站，（美國Agilent公司）。

離子色譜儀：Dionex ICS-5000，包括梯度混合泵、紫外和電導(dǎo)檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器、儀器控制和數(shù)據(jù)處理工作站，（美國Thermo Scientific公司）。

高速冷凍離心機(jī)（Sigma 3K 30，Sigma公司），超純水系統(tǒng)（Millipore QS，Millipore公司），pH計(jì)（奧立龍）。

1.2 材料試劑

腺嘌呤核苷一磷酸（AMP）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW09809），胞嘧啶核苷一磷酸（CMP）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW09810），鳥嘌呤核苷一磷酸（GMP）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW09811），尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW09812），次黃嘌呤核苷一磷酸（IMP）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW09813）；甲醇（色譜純）、乙酸（優(yōu)級(jí)純）、磷酸二氫鉀（分析純）、磷酸氫二鉀（分析純）、氯仿（色譜純）、雞精（市售）。

1.3 核苷酸提取分離

優(yōu)化了酸堿沉淀和有機(jī)溶劑沉淀兩種方法提取雞精中核苷酸的技術(shù)參數(shù)，并對(duì)兩種提取方法進(jìn)行了比較，最后確定了氯仿沉淀和高速離心相結(jié)合的核苷酸提取方法。具體步驟為：1）用天平精確稱量0.5g雞精樣品（準(zhǔn)確至0.000 1g），加入10 g超純水后震蕩混勻1min；2）50～60℃水浴30min，每5min混勻震蕩一次，使雞精中核苷酸充分溶解；3）室溫靜止60min后，加入10mL色譜純的氯仿，震蕩混勻1min；4）20000 r/min離心20 min；5）取上清液過0.22 μm濾膜，4℃貯存待測。

1.4 核苷酸色譜分離分析條件

1.4.1 高效液相色譜條件

色譜柱為Phenomenex，Gemini C18柱，250 mm ×4.6mm（i.d.），粒徑5μm；柱溫25℃；檢測器為DAD檢測器；進(jìn)樣量10μL；檢測波長：AMP 257nm，CMP 280 nm，GMP.2Na 254 nm，UMP.2Na 262 nm，IMP.2Na 249nm。

流動(dòng)相由兩部分組成，其中，流動(dòng)相A為0.1mol/ L磷酸二氫鉀溶液，pH 5.6；流動(dòng)相B為0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液，pH 5.6，20%（v/v）甲醇。流動(dòng)相梯度變化見表1。

表1 雞精中核苷酸含量測量色譜梯度洗脫條件

1.4.2 離子色譜分離分析條件

色譜柱：IonPac AGl6保護(hù)柱，IonPac ASl6分離柱；柱溫25℃；檢測器UV檢測器；進(jìn)樣量10μL；檢測波長：AMP 257nm，CMP 280nm，GMP.2Na 254nm，UMP.2Na 262nm，IMP.2Na 249nm。

流動(dòng)相：KOH溶液。

梯度洗脫程序：0～12min，12mmol/L；12～22min，由12 mmol/L線性增加至55 mmol/L；22～28 min，55 mmol/L；28～28.1 min，由55 mmol/L線性降低至12mmol/L；28.1～33min，12mmol/L，恢復(fù)至平衡狀態(tài)，流速1.0mL/min。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值及不確定度分析

通過優(yōu)化流動(dòng)相、離子強(qiáng)度、pH、有機(jī)相含量、分離柱、溫度、電壓等分離分析條件，建立了呈味核苷酸高效液相色譜、離子色譜兩種定量分析方法，以國家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為依據(jù)，用這兩種方法進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值的確定。利用液相色譜方法檢驗(yàn)了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性、考察了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性。基于與國家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較，建立了對(duì)復(fù)雜基體中目標(biāo)成分含量進(jìn)行確定的不確定度評(píng)定模型，以此評(píng)定雞精基體中呈味核苷酸含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值的不確定度。

2 結(jié)果與討論

2.1 核苷酸提取

市售雞精成分復(fù)雜，具有相似性質(zhì)的組份在分析時(shí)會(huì)相互干擾，因此，核苷酸和干擾成分的有效分離是進(jìn)行定量分析的基礎(chǔ)。現(xiàn)常用的分離方法有酸堿沉淀法和層析柱法。酸堿沉淀法可有效地將雜質(zhì)組份與核苷酸分離開來，方法的重復(fù)性、準(zhǔn)確度均較好，回收率可以達(dá)到99%以上；但該方法技術(shù)條件要求較高，需要高速離心機(jī)、pH計(jì)等精密儀器，同時(shí)要嚴(yán)格控制酸堿等試劑的加入量，對(duì)技術(shù)人員要求高。層析柱法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要精密儀器，技術(shù)要求也不高，普通實(shí)驗(yàn)室和一般技術(shù)人員均可操作完成；但其準(zhǔn)確度不高，回收率無法保證，限制其廣泛應(yīng)用。氯仿沉淀和高速離心相結(jié)合的核苷酸提取方法可有效地將雞精中對(duì)核苷酸定量分析產(chǎn)生干擾的成分分離開來。氯仿和水不互溶，可使蛋白質(zhì)完全變性沉淀析出，使脂類溶于氯仿中被萃取出來，從而有效去除蛋白質(zhì)和脂類對(duì)核苷酸定量分析的影響；水相中含有鹽、糖、味精、麥芽糊精等水溶性成分，這些成分均沒有紫外吸收，對(duì)基于紫外吸收特性檢測的核苷酸定量分析沒有干擾。該方法操作簡便，雖然也需要高速離心機(jī)，但是對(duì)技術(shù)人員的要求不高，普通實(shí)驗(yàn)人員即可完成。且本方法的重復(fù)性、準(zhǔn)確度均好于酸堿沉淀和柱層析方法。圖1為用氯仿和高速離心方法處理后的核苷酸的高效液相色譜分析圖譜。

圖1 氯仿沉淀處理雞精樣品后HPLC測定圖譜

由圖1可以看出，IMP、GMP和其他干擾成分已經(jīng)有效分離開，滿足了定量分析的需要。

2.2 核苷酸色譜分離分析條件的優(yōu)化

2.2.1 核苷酸HPLC色譜分離分析條件

用氯仿和高速離心法處理樣品可將絕大部分干擾成分去除，但是雞精成分較復(fù)雜，除了標(biāo)示的主要成分外，還含有少量可能對(duì)核苷酸定量分析產(chǎn)生干擾的成分，從圖1也可以看出，色譜圖中仍有雜質(zhì)峰。因此，優(yōu)化色譜分析條件，使核苷酸和其雜質(zhì)成分有效分開是對(duì)其定量的必要條件。分別使用5種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及相對(duì)應(yīng)的核苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行色譜條件建立和驗(yàn)證，能夠?qū)塑账徇M(jìn)行準(zhǔn)確的定量[6-7]。5種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的HPLC測量圖譜見圖2，5種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和相對(duì)應(yīng)的核苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC測量圖譜見圖3。從圖2和圖3可知，5種核苷酸自身與其相對(duì)應(yīng)的核苷都得到有效分離，可以進(jìn)行定量分析。

圖2 5種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的HPLC測量圖

圖3 5種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和相對(duì)應(yīng)的核苷標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC測量圖譜

2.2.2 核苷酸離子色譜分離分析條件

分別使用5種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行色譜條件建立和驗(yàn)證，能夠?qū)塑账徇M(jìn)行準(zhǔn)確的定量。5種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的IC測量圖譜見圖4，從圖4可知5種核苷酸達(dá)到了基線分離，可以進(jìn)行定量分析。

圖4 5種核苷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的IC測量圖譜

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性考察

按照國家計(jì)量技術(shù)規(guī)范JJF 1343—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》中對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性評(píng)估的技術(shù)要求，從研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取15個(gè)包裝用高效液相色譜法做均勻性檢驗(yàn)。采用F檢驗(yàn)法對(duì)均勻性測量數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果見表2。查表得到，F(xiàn)（0.05）=2.31，F(xiàn)＜F（0.05），證明研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品均勻一致，符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制均勻性的要求。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性考察

雞精基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性檢驗(yàn)采用高效液相色譜法進(jìn)行測定。采用國家計(jì)量技術(shù)規(guī)范JJF 1343—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》推薦的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)方法進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性檢驗(yàn)及評(píng)價(jià)，檢驗(yàn)結(jié)果見圖5。從圖5可知，在12個(gè)月時(shí)間內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值無顯著性變化，符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性要求，檢驗(yàn)結(jié)果為穩(wěn)定。

表2 雞精標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

圖5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性監(jiān)測結(jié)果

2.5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

利用高精密度方法將復(fù)雜基體中目標(biāo)成分含量與已知的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)直接比較而確定其特性量值是基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制最有效的方法之一。利用本文建立的高效液相色譜和高效離子色譜兩種方法，依據(jù)JJF 1343—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》的要求和ISO導(dǎo)則34的要求，對(duì)雞精中每個(gè)核苷酸的含量進(jìn)行精確定量測定，確定了其特性量值，結(jié)果見表3。

表3 雞精基體核苷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果

2.6 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值不確定度分析

本文中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值結(jié)果不確定度評(píng)估主要從核苷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制及系列稀釋、儀器測量、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不均勻性、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不穩(wěn)定性等部分進(jìn)行了考察。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書得到，將其轉(zhuǎn)換為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度（uC）。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品的配制產(chǎn)生的不確定度（uB）主要包含天平本身的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性兩部分。儀器測量不確定度（uM）用多次重復(fù)測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。色譜不響應(yīng)成分帶來的不確定度（uS）用水分和無機(jī)離子重復(fù)測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。不均勻性帶來的不確定度（uH）和不穩(wěn)定性帶來的不確定度（uT）由ISO導(dǎo)則35規(guī)定的計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算。用如下公式進(jìn)行合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算：

結(jié)果為

2.7 定值結(jié)果

定值結(jié)果表示為標(biāo)準(zhǔn)值±擴(kuò)展不確定度。取包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度可以表示為U=k·u。雞精基體（IMP+GMP）核苷酸定值結(jié)果為：IMP：（4.08± 0.32）g/100g，（k=2）；GMP：（4.46±0.30）g/100g，（k=2）。

3 結(jié)束語

針對(duì)國家調(diào)味品質(zhì)量檢驗(yàn)監(jiān)督急需的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀缺問題，建立了有機(jī)溶劑法提取核苷酸的技術(shù)手段。以核苷酸國家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)，采用高效液相色譜外標(biāo)法、離子色譜外標(biāo)法兩種技術(shù)對(duì)雞精基體中呈味核苷酸特性量值進(jìn)行了確定，建立了基于離子色譜和高效液相色譜兩種外標(biāo)法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值進(jìn)行確定的不確定度評(píng)定模型，評(píng)定了定值結(jié)果的不確定度，為復(fù)雜基體中核苷酸含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供了借鑒。為呈味核苷酸檢測的相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)制定提供了技術(shù)參考。

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Study on matrix reference material of flavor nucleotides

LI Han1，GAO Yun-hua2，WU Di1，LI Qian-qi1，YANG Yi1
（1.Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China；2.National Institute of Metrology，Beijing 100013，China）

The reference material of flavor nucleotides on the chicken essence matrix had been developed.The method was established for extraction the nucleotide with chloroform.The primary reference material for nucleotide had been used as the standard for certifying the value of flavor nucleotides reference materials by the high performance liquid chromatography and ionic chromatography.The homogeneity of reference materials had been tested and the result was good. The stability of reference materials has been monitored and there was no significant difference between the characteristic values within a year.A model was developed to evaluate the uncertainty of reference material of flavor nucleotides on the chicken essence matrix.This paper can be used as the reference for developing the complex matrix nucleotide content reference material and provide the technical information for national standards of nucleotide.

chicken essence；matrix；flavor nucleotides；content；reference material；uncertainty of referenle material

TS264.2+3；O629.74；O657.7+2；Q524

：A

：1674-5124（2014）05-0061-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.05.016

2014-01-19；

：2014-03-23

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（02-08-4GZ）國家質(zhì)檢總局食品安全監(jiān)管專項(xiàng)（ASPAQ1201）

李 涵（1987-），女，遼寧本溪市人，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。