不同嗜鹽機(jī)制微生物蛋白質(zhì)組特性及其識別

葛慧華，黃可君，張光亞

（華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 廈門361021）

來源于嗜鹽菌［1］的嗜鹽酶（尤其是水解酶）能適應(yīng)高濃度鹽，也能忍受很寬的p H值，在醫(yī)藥、食品、紡織及化工產(chǎn)業(yè)等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用［2］.嗜鹽微生物的嗜鹽機(jī)理一直是研究者關(guān)注的焦點(diǎn)，目前已發(fā)現(xiàn)微生物主要通過兩種方式對抗胞外的高鹽環(huán)境［3-5］：1）在細(xì)胞內(nèi)積累高濃度的K＋以對抗高滲環(huán)境（saltin）；2）在細(xì)胞內(nèi)積累細(xì)胞相容性溶質(zhì)來抗衡外界鹽環(huán)境的負(fù)面影響（salt-out）.近年來，隨著嗜鹽微生物基因組和蛋白質(zhì)組計(jì)劃的完成，對第一種嗜鹽機(jī)制微生物蛋白質(zhì)組的分析日益增加［6］，而對后一種適應(yīng)機(jī)制的微生物蛋白質(zhì)組的研究則很少.由于細(xì)胞相容性物質(zhì)都有帶電荷的基團(tuán)（如氨基酸來源的相容性物質(zhì)），因此蛋白質(zhì)為了在高濃度的細(xì)胞相容性物質(zhì)中保持溶解性和穩(wěn)定性，必須減少其分子表面非極性的面積［7-8］.這種微生物中蛋白質(zhì)與其同源蛋白同樣存在與嗜鹽機(jī)制有關(guān)的差異，不過其差異程度相對較小［7］.生物信息學(xué)和比較蛋白質(zhì)學(xué)的發(fā)展為研究嗜鹽菌的機(jī)理提供了新思路，所得結(jié)果對設(shè)計(jì)新的嗜鹽蛋白具有積極指導(dǎo)價(jià)值［9-10］.然而，多數(shù)方法并未對兩種不同嗜鹽機(jī)制的蛋白進(jìn)行區(qū)分.本文選取了兩株不同嗜鹽機(jī)制的微生物及一株非嗜鹽微生物的全蛋白質(zhì)組序列，探討了不同嗜鹽蛋白穩(wěn)定性機(jī)制，并使用一種新型核函數(shù)的支持向量機(jī)方法對3種蛋白進(jìn)行了識別.

1 材料和方法

1.1 菌株選取及序列數(shù)據(jù)構(gòu)建

根據(jù)以下3點(diǎn)規(guī)則從數(shù)據(jù)庫選取微生物：1）必須是嗜鹽微生物，且基因組注釋已經(jīng)完成，可提供大量蛋白質(zhì)序列；2）所選取微生物最適生長溫度接近，減少了溫度對其氨基酸使用偏好的影響；3）微生物基因組的G＋C摩爾分?jǐn)?shù)非常接近，最大程度減少了GC摩爾分?jǐn)?shù)對氨基酸使用偏好的影響.所選取的嗜鹽菌分別為Halobacteriumsp.NRC-1和Halomonaselongata，前一個(gè)為細(xì)胞內(nèi)積累KCl（saltin）［11］，后一個(gè)為積累細(xì)胞相容性物質(zhì)（salt-out）［12］，而非嗜鹽菌為CaulobactercrescentusCB15［13］.這樣，它們在氨基酸使用上的差異就主要是由嗜鹽機(jī)制不同造成的.

使用Blastclust程序［14］共得到1 701，2 382及2 703條序列，其所占比例分別為25.1%，35.1%和39.8%.上述6 786條序列ID號，F(xiàn)ASTA格式的序列，以及蛋白質(zhì)長度等信息保存在一個(gè)基于Microsoft Access的數(shù)據(jù)庫中.

1.2 氨基酸組成差異

考慮到蛋白質(zhì)序列中20種氨基酸出現(xiàn)的頻率存在較大差異，因此，在比較不同氨基酸組成差異的時(shí)候需要考慮這個(gè)因素，以使結(jié)果更能反映真實(shí)差異［15］.為此，統(tǒng)計(jì)了Uniprot數(shù)據(jù)庫中所有蛋白序列氨基酸組成，并計(jì)算3種微生物中各蛋白質(zhì)氨基酸組成.兩種嗜鹽蛋白Halobacteriumsp.NRC-1和Halomonaselongata分別表示為HIP和HOP，其與非嗜鹽蛋白（表示為NP）氨基酸組成的差異為

式（1）～（2）中：Nj，I，Nj，O和Nj，N分別表示積累鹽離子（salt-in）、細(xì)胞相容性物質(zhì)（salt-out）及非嗜鹽蛋白標(biāo)準(zhǔn)化的氨基酸組成；j表示20種氨基酸；Cj，I，Cj，O和Cj，N分別表示這3種蛋白中氨基酸組成；Cj，av表示Uniprot數(shù)據(jù)庫所有序列氨基酸組成平均值.經(jīng)計(jì)算，3種蛋白質(zhì)組累計(jì)統(tǒng)計(jì)的氨基酸數(shù)量分別為525 159，805 826和896 556.

1.3 有效性檢驗(yàn)

在評估模型優(yōu)劣過程中，經(jīng)常采用獨(dú)立樣本測試、交叉驗(yàn)證和Jackknife測試3種方法［16-17］.在實(shí)際操作過程中，該法運(yùn)算速度較慢且消耗計(jì)算機(jī)資源龐大，因此，交叉驗(yàn)證被越來越多的研究者采用［18-20］，而它實(shí)際上是Jackknife測試的一個(gè)特例.文中采用10倍交叉驗(yàn)證（10-CV）.

1.4 識別效果評估

模型最終表現(xiàn)通過以下2個(gè)參數(shù)進(jìn)行描述，預(yù)測準(zhǔn)確率（γ）和受試者操作特性曲線下面積（A）.一般而言，分類器的A值大于0.9，則被認(rèn)為優(yōu)秀.文中實(shí)現(xiàn)所有算法的軟件均來自于懷卡托智能分析環(huán)境（Weka 3-6-8）［21］，使用DELL precisionTM490工作站，所有運(yùn)行參數(shù)均采用默認(rèn)值.

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種嗜鹽蛋白與非嗜鹽蛋白氨基酸組成差異

經(jīng)與非嗜鹽蛋白比較，兩種嗜鹽與非嗜鹽蛋白氨基酸組成存在較明顯差，如圖1（a）所示.為此，特定義在 HIP或 HOP中，若｜Dj，I-N｜＞0.25或｜Dj，O-N｜＞0.25，則氨基酸j視為顯著性氨基酸.可見，在HIP中存在較多的Asp，Thr和Val，較少的Lys，Trp和 Met；而HOP中這種顯著性氨基酸則明顯較少，只有較多的His和較少的Ala.Asp作為一種酸性氨基酸在嗜鹽蛋白（salt-in）中大量存在，這已得到廣泛證實(shí).Asp主要存在于蛋白分子表面，與陽離子（如K＋）相互作用，從而增加嗜鹽蛋白的穩(wěn)定性.此外，其分子中堿性氨基酸（如Lys）的含量則顯著減少［22］.Thr由于側(cè)鏈帶有羥基，非常容易和環(huán)境中水分子形成氫鍵，有助于蛋白在高鹽濃度中保持可溶性及結(jié)構(gòu)和功能.Val具有一定疏水性，且分子較小，有利于保持嗜鹽蛋白更緊湊的疏水核心，從而增加其穩(wěn)定性［23］.Met是一種疏水性較強(qiáng)的氨基酸，而研究表明嗜鹽蛋白穩(wěn)定性與其較低的疏水性有關(guān)［24］，因此，Met在嗜鹽蛋白中含量較低.Trp屬于芳香族且疏水性較強(qiáng)，研究表明芳香族氨基酸在嗜鹽蛋白中含量很少［25］.

對HOP（通過細(xì)胞相容性物質(zhì)穩(wěn)定的蛋白）而言，其與非嗜鹽蛋白的氨基酸組成雖然也存在差異，但相比于HIP則明顯較少.其中His較多而Ala則較少.Costantini等［26］認(rèn)為，Ala非常容易形成α-螺旋，而His則具有很強(qiáng)的無規(guī)則卷曲形成趨向.眾所周知，α-螺旋是一種較剛性的結(jié)構(gòu)，而無規(guī)則卷曲則極具柔性，減少α-螺旋和增加無規(guī)則卷曲可增加蛋白質(zhì)分子的柔性，而分子柔性與其功能密切相關(guān)［27］.這很可能有助于蛋白在細(xì)胞相容性物質(zhì)濃度較高的細(xì)胞液中保持穩(wěn)定.

為了進(jìn)一步了解其差異，參考相關(guān)文獻(xiàn)［28］把氨基酸分成14種類型，包括帶電的（Ch），脂肪族（Al）、芳香族（Ar）、極性的（Po）、中性的（Ne）、疏水性的（Hy）、帶正電（Ps）、帶負(fù)電（Ng）、微小的（Ti）、小的（Sm）、大的（La）、含硫的（Su）、酰胺（Am）及酸性與堿性氨基酸（A-B）的差值.比較它們在 HIP及HOP與NP中的差異，結(jié)果如圖1（b）所示.

由圖1（b）可知：HIP中性氨基酸、微小的氨基酸及帶電氨基酸明顯較高，疏水性氨基酸則明顯較少；而HOP中僅有較小的氨基酸明顯多于非嗜鹽蛋白.研究表明：中性氨基酸不與離子發(fā)生靜電引力，其在高鹽條件下很易形成疏水相互作用，而側(cè)鏈微小或較小的氨基酸在蛋白質(zhì)內(nèi)核組裝過程中更容易占據(jù)蛋白質(zhì)分子中不同空間［29］.這對維持蛋白穩(wěn)定性非常重要.

圖1 嗜鹽與非嗜鹽蛋白氨基酸組成的差異Fig.1 Compositional differences of amino acids between halophilic and non-halophilic proteins

此外，HIP和HOP與NP中酸性氨基酸與堿性氨基酸差值均差異明顯，尤其在HIP中.這與大多數(shù)研究所發(fā)現(xiàn)的嗜鹽蛋白酸性氨基酸含量明顯超過堿性氨基酸含量的結(jié)果吻合.然而，Bardavid等［30］的研究發(fā)現(xiàn)，在Halanaerobiales屬中一些在細(xì)胞內(nèi)積累高濃度KCl的嗜鹽蛋白并不存在這種差異.

綜上所述，對于HIP而言，文中結(jié)果與大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相吻合，但通過引入所有蛋白平均氨基酸組成使其結(jié)果更為明顯；而對HOP而言，其氨基酸組成差異雖然沒有HIP與NP這么明顯，但它們可能通過增加分子柔性及更高效的內(nèi)核組裝，來保持蛋白質(zhì)在高細(xì)胞相容性物質(zhì)環(huán)境中的可溶性、穩(wěn)定性及行使正確的生物學(xué)功能.

2.2 基于PUKF的支持向量機(jī)識別精度

支持向量機(jī)（SVM）是生物信息學(xué)領(lǐng)域最常用的分類工具［31］，其分類性能主要取決與核函數(shù)，而核函數(shù)的選取及其對應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化非常耗時(shí).為此，采用一種通用核函數(shù)，通過參數(shù)調(diào)整，可適應(yīng)各種數(shù)據(jù)［32-33］.文中選取Person通用核函數(shù)（PUKF）［32］，它在生物學(xué)領(lǐng)域尚不多見［34］.基于PUKF的支持向量機(jī)對兩種嗜鹽蛋白和兩種嗜鹽蛋白與非嗜鹽蛋白的識別效果，如表1所示.

表1 不同算法的預(yù)測精度Tab.1 Performances of different algorithms

對兩種嗜鹽蛋白而言，10-倍交叉驗(yàn)證的結(jié)果表明：基于PUKF的支持向量機(jī)識別精度最佳，可達(dá)92.5%.其A值為0.921，大于0.9，說明該分類器的識別效果優(yōu)秀.相比而言，其識別精度比單一分類器的徑向基核函數(shù)（RBF）的支持向量機(jī)高7.1%，比組合分類器的Bagging（基礎(chǔ)分類器為Decision Stump）高15.3%.此外，同其他幾種核函數(shù)的支持向量機(jī)相比，其準(zhǔn)確率分別高于RBF和線性核函數(shù)的7.1%和4.2%，與多項(xiàng)式核函數(shù)的支持向量機(jī)比較接近.然而，相對于后者，PUKF的支持向量運(yùn)算所需時(shí)間明顯較少，如完成本次運(yùn)算，前者所需時(shí)間約6 min，而同樣條件下的多項(xiàng)式支持向量機(jī)（E＝5）所需時(shí)間約14 min，是前者的2倍多.由此可見，PUKF的支持向量機(jī)能兼顧運(yùn)算效率與運(yùn)算精度.

同樣，采用PUKF的支持向量對兩種嗜鹽蛋白與非嗜鹽蛋白進(jìn)行識別.對于這三種類型的蛋白，該方法的10-倍交叉驗(yàn)證驗(yàn)證的精度達(dá)到84.1%，其A值達(dá)到0.895，接近0.9，說明其識別精度依然令人滿意.相對與其他單一分類器而言，其精度提高0.5%至10.2%不等；相比組合分類器，其識別精度有6.3%至32%的提高；相比其他幾種常見核函數(shù)的支持向量機(jī)，其精度依然最佳，比RBF和線性核函數(shù)的支持向量機(jī)分別高出5.9%和8.5%；相比多項(xiàng)式核函數(shù)的支持向量機(jī)，也有0.5%至1.7%左右的提升，識別效果基本相當(dāng)，但其運(yùn)算效率則提升明顯.因此，在本識別過程中，PUKF的支持向量機(jī)算法表現(xiàn)最好，而且其運(yùn)算精度高、速度快，對計(jì)算機(jī)資源的消耗較少，在大規(guī)模數(shù)據(jù)分析方面更具優(yōu)勢.

此外，本方法對兩種嗜鹽及非嗜鹽蛋白識別精度為84.1%，雖然未能達(dá)到預(yù)期的90%以上，但相比對這3種類型蛋白進(jìn)行隨機(jī)猜測的幾率33.3%而言，其效果已明顯提高了53.8%；而對兩種嗜鹽的識別精度達(dá)92.5%，相比于隨機(jī)猜測的幾率50%而言，其精度提高了42.5%.由此看來，對3種不同類型蛋白識別的精度還是令人滿意的.

2.3 不同長度序列預(yù)測精度的差異

當(dāng)使用氨基酸組成作為序列特征值時(shí)，識別精度隨序列長度的變化而出現(xiàn)差異.這種現(xiàn)象在之前的相關(guān)研究中已有報(bào)道.如Grominha［35］在識別球狀蛋白和外膜蛋白過程中發(fā)現(xiàn)，對少于300個(gè)氨基酸的蛋白而言，其識別精度為86%，對氨基酸數(shù)量在300～800之間的蛋白，其識別精度高達(dá)98%，而對大于800個(gè)氨基酸的蛋白，其精度為100%.Zhang等［36］對嗜熱和常溫蛋白的預(yù)測結(jié)果也表明，對小分子蛋白（少于200個(gè)氨基酸），其識別精度為僅為79%，而對大分子蛋白（大于800個(gè)氨基酸）的識別精度則達(dá)100%.然而，研究者并未對此現(xiàn)象進(jìn)行過多的解釋，其可能的原因也未作進(jìn)一步探討.

按照序列長度（L）將蛋白質(zhì)序列分為4個(gè)類型，并進(jìn)行自一致性檢驗(yàn)，其平均識別精度為89.5%，不同長度蛋白質(zhì)序列的識別精度分析結(jié)果，如表2所示.表2中：L為序列長度；n為序列數(shù)量；nc為正確預(yù)測的序列數(shù)量；φ為不同長度蛋白質(zhì)序列數(shù)量的百分比；η為預(yù)測的準(zhǔn)確率.從表2可知：隨著蛋白質(zhì)序列長度的增加，識別精度逐漸上升，對較小的蛋白分子，其識別精度為86.2%，比平均值低3.3%；對大分子蛋白，其識別精度達(dá)97.1%，比平均值高出7.6%；而對中等大小（200～800）的識別精度也均高于平均值.

表2 不同長度蛋白質(zhì)序列的預(yù)測結(jié)果Tab.2 Prediction performances of different sequence lengths

3 結(jié)論

文中嚴(yán)格區(qū)分兩種不同嗜鹽機(jī)制的蛋白，并分別將其同非嗜鹽微生物蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較.結(jié)果表明：對HIP而言，其結(jié)果與報(bào)道結(jié)果吻合，而對HOP而言，其分子中含有更多柔性的二級結(jié)構(gòu)，同時(shí)分子中較小的氨基酸占多數(shù)，這在之前相關(guān)文獻(xiàn)中未見報(bào)道.這對認(rèn)知兩種不同嗜鹽機(jī)制蛋白穩(wěn)定性的機(jī)制及對結(jié)構(gòu)和功能強(qiáng)化的理性設(shè)計(jì)具有重要指導(dǎo)意義.

此外，從蛋白質(zhì)類型而言，出現(xiàn)預(yù)測錯(cuò)誤主要是HOP與NP之間，而從蛋白質(zhì)大小而言，主要是對分子量小的蛋白預(yù)測精度偏低.因此，如何有效解決上述兩個(gè)問題以提高識精度將是后續(xù)研究重點(diǎn).

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