響應面分析法優(yōu)化超聲輔助提取紅肉蘋果花青苷工藝

竇玉慧，孫曉紅，2，祝軍，張玉剛，戴洪義*

（1.青島農業(yè)大學園藝學院，山東青島266109；2.青島農業(yè)大學生命科學學院，山東青島266109）

響應面分析法優(yōu)化超聲輔助提取紅肉蘋果花青苷工藝

竇玉慧1，孫曉紅1，2，祝軍1，張玉剛1，戴洪義1*

（1.青島農業(yè)大學園藝學院，山東青島266109；2.青島農業(yè)大學生命科學學院，山東青島266109）

采用響應面分析法優(yōu)化超聲波輔助提取紅肉蘋果花青苷的提取工藝。以花青苷的含量作為響應值，在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理采用4因素3水平的響應面分析法對各因素進行分析，結果表明，紅肉蘋果花青苷的最佳提取條件為丙酮體積分數(shù)80%，料液比1∶14（g∶mL），超聲時間32min，鹽酸含量1.2%，在此條件下提取的花青苷的質量濃度為7.01mg/100mL，與響應面預測理論值（7.09mg/100mL）相當。

紅肉蘋果；花青苷；工藝優(yōu)化；響應面分析

花青苷是天然存在的最多的一類水溶性色素[1]，也是重要的植物次生代謝產物[2]。蘋果果皮、果肉的顏色主要取決于花青苷的含量，而花青苷含量的多少不僅影響果實的商品特性也影響果實本身的營養(yǎng)價值[3]?；ㄇ嘬諏儆邳S酮類化合物[4]，具有很強的抗氧化能力，在預防與生活方式息息相關的疾?。ㄈ绨┌Y、糖尿病和心血管病等）方面發(fā)揮著重要作用[5]。如今人們對一些天然的有色作物的興趣迅速的增加[6]，因此人們對色彩豐富的水果蔬菜及其加工品需求的增加。新疆有很長的栽培紅肉蘋果歷史且具有大量的紅肉蘋果資源。‘紅勛一號’是原產于新疆的一個新的紅肉蘋果[（Malus sieversii f.neidzwetzkyana）（Dieck）Langenfnative]品種[7]，其花青苷含量豐富。矢車菊素是蘋果中最常見的花青素，3-葡萄糖苷是花青素中最活躍的抗氧化劑的形式[8]。充分利用‘紅勛一號’紅肉蘋果中的花青苷對于當?shù)氐姆N植業(yè)以及加工企業(yè)都將產生巨大的經濟效益。而目前多數(shù)關于花青苷的定量、純化、分離都依賴于昂貴的設備或是復雜的樣品準備[9]。因此選擇一種簡便、快捷的提取工藝具有重要的意義。

超聲波輔助技術[10]作為一種先進的提取方法具有操作簡便快捷、提取溫度低、提取率高、提取物的結構不被破壞等特點，結合響應面分析法（response surface methodology，RSM）[11]得到紅肉蘋果花青苷提取的最佳工藝條件。RSM是一種有效的生物統(tǒng)計方法，且目前已廣泛應用于農業(yè)及生物研究等方面[12-14]，許多研究表明該方法對于一些流程的開發(fā)、改進、優(yōu)化作用巨大[15-16]。本試驗利用RSM來研究各因素超聲時間、溶劑濃度、溶劑中酸含量和料液比對紅肉蘋果花青苷提取的效率的影響，最終得到紅肉蘋果花青苷超聲波輔助提取的最佳條件，為以后的科研以及加工生產提供一種高效的提取方式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘洪勛1號’紅肉蘋果于2013年9月15日摘自青島農業(yè)大學膠州農場，清洗干凈，室溫條件下風干，移除果柄及果核，將果肉果皮分離且切成碎塊后分別置于-70℃液氮中迅速冷凍后用料理機將其粉碎成粉末后置于-80℃冰箱中存儲。

甲醇、乙醇、丙酮、鹽酸、氯化鉀和結晶乙酸鈉均為分析純：天津市巴斯夫化工有限公司。

1.2 儀器設備

HP2500型超聲波清洗器：保定圣峰儀器科技有限公司；SHB-III S循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；AR2140電子天平、Ultrospec 3300紫外分光光度計：安瑪西亞（中國）有限公司；JYL-350料理機：山東九陽小家電有限公司；S20K梅特勒-托利多pH計：上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ‘洪勛1號’紅肉蘋果花青苷的提取

在傳統(tǒng)提取方法的基礎上有些改動[17]：精確稱取1.0g‘洪勛1號’紅肉蘋果粉末于20mL試管中，按試驗設計要求加入相應的溶劑，在室溫條件下超聲一段時間，用布氏漏斗減壓抽濾得到花青苷提取液。

1.3.2 ‘洪勛1號’紅肉蘋果花青苷的測定

其含量測定采用pH示差法[18]。依據(jù)pH示差法的原理取0.025mol/L（pH1.0）的氯化鉀緩沖液和0.4mol/L（pH4.5）的乙酸鈉緩沖液各5mL分別加入1mL的待測樣品，混勻，室溫下避光平衡30min，用蒸餾水作空白，在矢車菊素-3-葡萄糖苷最大吸收波長510nm和700nm（校正渾濁度）處，測定吸光度值，稀釋樣品的吸光度值以及原始樣品中花青苷質量濃度按如下公式計算：

式中：MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷分子質量，449.2；DF為稀釋因子；ξ為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900；1為光程，cm。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溶劑種類及體積分數(shù)的確定

由于花青苷是極性化合物易溶于甲醇、乙醇、丙酮、水等極性溶劑[19]，選用甲醇、乙醇和丙酮作為提取劑。精確稱取1.0g果肉粉末63份，分別以不同體積分數(shù)的甲醇、乙醇、丙酮（含0.1%鹽酸）溶液按料液比1∶10（g∶mL），超聲輔助（室溫）提取30min，用分光光度計測定花青苷含量，每個梯度設平行試驗3次，考察不同提取溶劑對紅肉蘋果花青苷提取的影響，結果見圖1。

由圖1可知，隨著溶劑體積分數(shù)的增加，乙醇、丙酮的提取效果均呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢，而甲醇隨著提取液體積分數(shù)的增加花青苷的含量增加。但各體積分數(shù)變化條件下丙酮鹽酸水溶液的提取效果明顯優(yōu)于乙醇、甲醇，且在丙酮體積分數(shù)為80%時提取效果最好，故選用丙酮（含0.1%鹽酸）溶液作為紅肉蘋果花青苷提取的溶劑。

圖1 不同體積分數(shù)提取液對花青苷提取量的影響Fig.1 Effect of different volume fraction solvents on anthocyanin extraction from red-flesh apple

2.1.2 料液比的確定

精確稱取1.0g果粉24份，每個梯度重復試驗3次，分別按料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20（g∶mL）用體積分數(shù)為80%丙酮（含0.1%鹽酸）溶液在室溫下超聲輔助提取30min，考察不同料液比對紅肉蘋果花青苷提取的影響，結果見圖2。

圖2 料液比對花青苷提取量的影響Fig.2 Effect of different solid-liquid ratio on anthocyanin extraction from red-flesh apple

由圖2可知，隨著料液比的增加花青苷的提取量逐漸增加，但當料液比達到1∶14（g∶mL）時花青苷的提取量達到最大，說明果粉中的花青苷已經充分的提取出來了，再增加料液比花青苷的提取量反而會有減小的趨勢，而且還不利用提取成本的節(jié)約。

2.1.3 提取時間的確定

精確稱取1.0g果粉24份，每個梯度重復試驗3次，用體積分數(shù)為80%的丙酮（含0.1%鹽酸）溶液按料液比1∶14（g∶mL）在室溫下超聲輔助提取8min、16min、24min、32min、40min、48min、56min、64min，考察不同提取時間對紅肉蘋果花青苷提取的影響，結果見圖3。

圖3 超聲時間對花青苷提取量的影響Fig.3 Effect of different extraction time on anthocyanin extraction from red-flesh apple

由圖3可知，隨著超聲時間的延長，花青苷的提取越來越充分即提取量增大，當超聲時間為32min時紅肉蘋果花青苷提取量達到最大，之后隨著超聲時間的延長，花青苷的提取量降低，可能是由于花青苷結構的不穩(wěn)定性，隨著超聲時間的延長使部分花青苷降解。

2.1.4 鹽酸含量的確定

精確稱取1.0g果肉粉末24份，在體積分數(shù)為80%的丙酮溶液中分別加入0.05%、0.35%、0.65%、0.95%、1.25%、1.55%、1.85%、2.15%的鹽酸溶液，按料液比1∶14（g∶mL）室溫下超聲輔助提取32min，考察不同鹽酸添加量對紅肉蘋果花青苷提取的影響，結果見圖4。

圖4 鹽酸含量對花青苷提取量的影響Fig.4 Effect of different HCl concentration on anthocyanin extraction from red flesh apple

由圖4可知，隨著鹽酸含量的增加花青苷的提取量逐漸增加，當鹽酸含量為1.25%時花青苷的提取量最高，之后隨著鹽酸含量的繼續(xù)增加，花青苷的提取量急劇減少，可能由于隨著鹽酸含量的增加，花青苷的穩(wěn)定性降低，部分氧化降解。

2.2 提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 試驗因素及水平的選取

選取對花青苷的提取影響較大的丙酮體積分數(shù)、料液比、超聲時間、鹽酸含量4個因素，以提取的花青苷含量作為響應值。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，在上述單因素試驗的的基礎上利用Design Expert 8.0.7.01進行4因素3水平的響應面試驗設計，其中中心點試驗重復5次，試驗因素及水平見表1。

表1 超聲輔助提取紅肉蘋果的響應面分析因素及水平Table 1 Coded values of corresponding actual values of independent variables in response surface design

表2 超聲波輔助提取紅肉蘋果的響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding expreimental data

響應面優(yōu)化法即響應曲面法[20]，該法通過對過程的回歸擬合和響應曲面等高線等的繪制，求出響應與各因素、水平的響應值。利用Design Expert 8.0.7.1對表2中數(shù)據(jù)進行回歸分析得到其影響因素的一次效應、二次效應以及兩兩因素間交互作用的二元多次回歸方程：

2.2.2 回歸模型的方差分析

從表3可知，各因素對響應值（花青苷提取量）影響大小的順序依次為：酸量>丙酮體積分數(shù)>料液比>提取時間（根據(jù)F值的大?。四Ｐ瓦_到極顯著水平（P<0.000 1），失擬項各項分析表明該模型失擬不顯著（P>0.05）。決定系數(shù)R=0.962 3，表明90%以上的該類試驗可用該模型解釋，但并不是R值越大越好[21]，從表3中還可以得知該模型的一次項X1、X4和二次項X12、X22、X32、X42對響應值（花青苷提取量）的影響顯著。

2.2.3 響應面曲面分析

圖5 各因素交互作用對花青苷提取量影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plot and contour line of the pairwise interactive effects of four extraction conditions on extraction concentration of anthocyanin from red-flesh apple

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

RSM方法的圖形是特定的響應值（Y）與對應的因素X1、X2、X3、X4構成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，每個響應面對其中的兩個因素進行分析，另外兩個因素固定在零水平。從中可以直觀的反應各因素對響應值的影響，從試驗所得的響應面分析圖上可以找到其在提取過程中的相互作用[16]。相應曲面比較陡，說明此時各因素對響應值的影響較為顯著，反之，則各因素對響應值的影響較小。而等高線密度大，則影響因素對響應值貢獻就大，反之亦然[17]。

圖5直觀的反應了對響應值花青苷含量影響的大小。由圖5可知，A因素丙酮體積分數(shù)和D因素對響應值花青苷的濃度的影響較為顯著，表現(xiàn)為響應面的坡度較陡，等高線呈現(xiàn)橢圓形且等高線的密度較大，另從等高線圖可知其A丙酮體積分數(shù)與C超聲時間和B料液比與超聲時間的交互作用不強，即對響應值的影響不大，表現(xiàn)為等高線呈現(xiàn)圓形。

根據(jù)所得模型及以上的響應面分析可以預測超聲波輔助提取‘洪勛1號’紅肉蘋果花青苷提取的最佳工藝條件為室溫下丙酮體積分數(shù)78.94%，料液比13.91（g∶mL），超聲時間31.77min，鹽酸含量1.21%，在此條件下，紅肉蘋果花青苷含量理論值為7.09mg/100mL。

2.2.4 試驗結果的驗證

為了驗證上述模擬試驗結果的準確與否，對其進行驗證試驗（n=3），考慮到實際操作的方便在室溫下，丙酮體積分數(shù)取80%，料液比取1∶14（g∶mL），超聲時間32min，鹽酸含量取1.2%條件下所得紅肉蘋果花青苷含量為7.01mg/100mL，且平行試驗的重復性較好，與理論預測值紅肉蘋果花青苷含量7.09mg/100mL無顯著差異（P＞0.05）。所以采用Box-Behnken中心組合試驗設計結合響應面分析法得到的花青苷的工藝條件可靠。

3 結論

采用超聲輔助提取技術，根據(jù)Box-Benhnken中心組合的試驗設計原理，結合響應面分析法確定了室溫下‘洪勛1號’紅肉蘋果花青苷提取的最佳工藝條件為丙酮體積分數(shù)80%，料液1∶14（g∶mL），超聲時間32min，鹽酸含量1.2%，在該條件下提取的花青苷含量為7.01mg/100mL，并得到以提取的花青苷含量作為因變量與各處理因素作為自變量的二次多元回歸模型，該模型及顯著對試驗擬合較好，具有一定的指導意義。

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Optimization of ultrasonic-assisted solvent extraction of anthocyanin from red-flesh apple by response surface methodology

DOU Yuhui1,SUN Xiaohong1,2,ZHU Jun1,ZHANG Yugang1,DAI Hongyi1*
(1.College of Horticulture,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China; 2.College of Life Science,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

Response surface methodology was used to optimize the process for the solvent extraction of anthocyanin from red-flesh apple with ultrasonic assistance.Taking cyanine glucoside content as response value,on the basis of single factor experiment,Box-Behnken central composite design and four factors three levels response surface analysis theory to optimize the anthocyanin extraction process.Result showed that the optimum conditions for anthocyanin extraction were determined as follows:acetone concentration 80%,solid-liquid ratio 1∶14(g/ml),extraction time 32 min,and acid concentration 1.2%.Under such condition,the concentration of anthocyanin was 7.01 mg/100 ml,close to the predicted value 7.09 mg/100 ml.

red-flesh apple;anthocyanin;process optimization;response surface methodology

S661.1

A

0254-5071（2014）04-0065-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.016

2014-03-11

國家現(xiàn)代蘋果產業(yè)技術體系項目（CARS-28-01-07）

竇玉慧（1989-），女，碩士研究生，研究方向為果樹育種與生物技術。*

戴洪義（1956-），男，教授，碩士，研究方向為果樹育中與生物技術。