高收率低苦味值大豆低聚肽的制備

谷宇，劉艷，涂鈺，蘆明春*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034；2.江蘇三儀科研質(zhì)量控制中心，江蘇邳州221300）

高收率低苦味值大豆低聚肽的制備

谷宇1，劉艷2，涂鈺1，蘆明春1*

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034；2.江蘇三儀科研質(zhì)量控制中心，江蘇邳州221300）

以大豆分離蛋白為原料，以酶解收率為指標(biāo)對最優(yōu)的酶解工藝進行研究。在單酶水解的基礎(chǔ)上，用復(fù)合堿性蛋白酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶進行水解，通過正交試驗確定了復(fù)合酶的最佳水解條件為：堿性蛋白酶/中性蛋白酶/胰蛋白酶加酶1∶2∶3，溫度50℃，酶解時間4.5h，在此最佳條件下，酶解收率為86.76%，大豆低聚肽含量為93.49%，苦味值比單酶水解明顯降低。

大豆低聚肽；酶解收率；苦味值

大豆低聚肽是指大豆分離蛋白經(jīng)過酶解、分離、脫色、脫鹽、超濾、濃縮、噴霧干燥等工藝精制而成的肽混合物，主要由3～6個氨基酸殘基組成的低肽混合物，還含有少量大分子肽、游離氨基酸等成分[1-3]。與傳統(tǒng)大豆蛋白相比，大豆低聚肽具有酸溶特性、乳化性、熱穩(wěn)定性、高流動性和高吸水性等優(yōu)良的理化性質(zhì)[4-6]。另一方面，大豆低聚肽還具有獨特的生理功能，如低抗原性、阻止膽固醇水平升高、降壓、恢復(fù)疲勞、抗氧化、減肥等[7-9]。目前，大豆低聚肽的制備單酶水解法較為常見，酶解法的反應(yīng)條件溫和，過程容易控制，而且對氨基酸的破壞小[10]。此法簡單易行，但存在水解液較苦，水解度不高等問題[11]。有文獻報導(dǎo)，多酶復(fù)合水解的水解收率要顯著高于單酶水解收率[12]。大豆低聚肽分子質(zhì)量的檢測耗時耗力成本高，在不必要時可以用三氯乙酸法（trichloroacetic acid，TCA）代替，高分子蛋白質(zhì)在酸性條件下易被沉淀，相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)水解物（酸溶蛋白）可溶于酸性溶液（其中包含肽及游離氨基酸）。樣品經(jīng)酸化后，濾液中的酸溶蛋白含量減去游離氨基酸含量即為肽含量[13]。

本研究主要對復(fù)合酶酶解大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）工藝以及降低苦味值的條件進行研究。為生產(chǎn)收率更高、苦味更低的大豆低聚肽提供理論基礎(chǔ)，進一步擴展大豆低聚肽在食品中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白：山東御馨蛋白有限公司；堿性蛋白酶：河南仰韶生化工程有限公司；中性蛋白酶：南寧東恒華道生物科技有限公司；胰蛋白酶、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、三氯乙酸、甲醛等均為分析純：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SH220石墨消解儀、K9840型自動凱氏定氮儀：濟南海能儀器有限公司；80-3大容量離心機、JJ-1定時電動攪拌器、85-1恒溫磁力攪拌器：江蘇金壇市中大儀器廠；DK-B824電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；UB-7pH計：丹佛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解方法

將大豆分離蛋白按照固液比1∶25加水?dāng)嚢瑁跍囟?5℃，pH9.0，時間10min的條件下進行預(yù)處理，調(diào)至酶解溫度、酶解pH值，加酶酶解一定時間，沸水浴滅酶15min，5 500r/min條件下離心10min，取上清液，量取上清液體積，測定蛋白含量、游離氨基酸含量、苦味值等。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定方法

采用凱氏定氮法測定。

1.3.3 酸溶蛋白含量的測定

根據(jù)GB/T 22492—2008《大豆肽粉》中方法測定。

1.3.4 游離氨基酸含量的測定

根據(jù)GB/T5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中方法測定。

1.3.5 大豆低聚肽含量計算

大豆低聚肽含量=酸溶蛋白含量-游離氨基酸含量

1.3.6 苦味評價方法

稱取鹽酸奎寧0.1g溶于100mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液中，取10mL用水稀釋至100mL，配成質(zhì)量濃度1.0×10-4g/mL的鹽酸奎寧溶液，再分別稀釋到9.0×10-5g/mL、8.0×10-5g/mL、7.0×10-5g/mL、6.0×10-5g/mL、5.0×10-5g/mL、4.0×10-5g/mL、3.0×10-5g/mL、2.0×10-5g/mL、1.0×10-5g/mL，其苦味值分別定為10～1。通過品嘗方法將大豆分離蛋白的酶解液與不同濃度的鹽酸奎寧比較，確定苦味值[6]。

1.3.7 酶解收率計算

1.3.8 最佳酶解工藝的確定

酶解收率為指標(biāo)，進行單酶試驗，在單酶試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)堿性蛋白酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶最優(yōu)水解條件，進行3種酶復(fù)合酶解。以加酶比例（堿性蛋白酶/中性蛋白酶/胰蛋白酶），酶解溫度，酶解pH值，酶解時間為試驗因素，進行正交試驗優(yōu)化復(fù)合酶水解大豆分離蛋白條件，酶解條件優(yōu)化正交試驗因素水平見表1。

表1 大豆分離蛋白酶解條件優(yōu)化正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for soy protein isolate hydrolysis condition optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 單酶水解

根據(jù)大豆分離蛋白酶解工藝的特性，經(jīng)過篩選，得到幾種比較理想的工具酶：堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶，固定加酶量5 000U/g SPI條件下，通過單因素及正交試驗進行條件優(yōu)化，得出這3種單酶的最適水解條件，結(jié)果見表2。

表23 種蛋白酶的最佳水解條件Table 2 The optimum hydrolysis conditions of three kinds of protease

2.2 復(fù)合酶水解

將堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶進行復(fù)配。以3種酶的比例、pH值、溫度、酶解時間為試驗因素，每個因素選取3個水平，以酶解收率為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計進行試驗，確定復(fù)合酶水解大豆分離蛋白的最佳酶解工藝條件組合，結(jié)果與分析見表3，方差分析見表4。

表3 大豆分離蛋白酶解條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for soy protein isolate hydrolysis condition optimization

表4 正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表3、表4可知，加酶比例是影響大豆分離蛋白酶解收率的最主要因素，其次是酶解時間、溫度，pH極差最小。綜合分析可知，最佳組合為A2B2C2D3，即加酶比1∶2∶3，pH值為8.5，溫度50℃，酶解時間4.5h。在此優(yōu)化酶解條件下，進行驗證試驗，復(fù)合酶得出酶解收率為86.76%。

2.3 單酶水解與三酶復(fù)配水解效果對比

在其他酶解條件相同（固液比1∶25，加酶量5000U/gSPI，酶解時間4.5h）的條件下，在3種單酶及復(fù)合酶的最佳酶解條件下，單酶水解與復(fù)合酶水解的酶解收率與苦味值結(jié)果見表5。

表5 單酶與復(fù)合酶水解效果對比Table 5 Comparison of the hydrolysis effect of single enzyme and compound enzyme

由表5可知，對比單酶與復(fù)合酶的水解效果，復(fù)合酶解收率僅略低于堿性蛋白酶，高于中性蛋白酶及胰蛋白酶，復(fù)合酶酶解的苦味值明顯低于單酶酶解。對比單酶與復(fù)合酶酶解的酶解收率及苦味值兩方面因素，復(fù)合酶更適合用于制備高收率、低苦味的大豆低聚肽。

3 結(jié)論

復(fù)合酶解大豆分離蛋白的最佳酶解條件為加酶比（堿性蛋白酶/中性蛋白酶/胰蛋白酶）1∶2∶3，pH值8.5，溫度50℃，酶解時間4.5h，在此最佳條件下，酶解收率為86.76%。通過酸溶蛋白含量的測定方法測得水解液中小分子大豆蛋白含量為98.04%。大豆肽的功能特性和營養(yǎng)特性主要由肽體現(xiàn)，游離氨基酸并不是所需要的功能性成分，所以，要保證生產(chǎn)高純度的大豆低聚肽，必須控制游離氨基酸含量，游離氨基酸含量為4.55%。通過計算，得到大豆低聚肽含量為93.49%。人類攝食的蛋白質(zhì)主要在胃及腸道中水解成肽，以肽的形式消化吸收[14]，二肽和三肽的吸收速度比相同組成的氨基酸更快[15]。所以大豆低聚肽更易被腸道消化吸收，能較快的為人體提供能量。復(fù)合酶解同單酶酶解效果相比，在保證適宜酶解收率的條件下，又能大大降低酶解液的苦味值。考慮酶解收率及苦味值方面因素，復(fù)合酶解比較適合用于制備高收率、低苦味值的大豆低聚肽。

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Preparation of soy oligopeptides with high yield and low bitterness

GU Yu1,LIU Yan2,TU Yu1,LU Mingchun1*
(1.College of Food Science,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China; 2.Jiangsu Sanyi Scientific Research Centre,Pizhou 221300,China)

Taking soybean protein isolate residue as raw material,the optimal hydrolysis process was studied with the enzymatic hydrolysis yield as index.On the basis of single enzyme hydrolysis,compound enzyme of alkaline protease,neutral protease and trypsin were used to conduct orthogonal experiment.The optimum hydrolysis condition of compound enzyme were determined by the orthogonal experiment as follows:alkaline protease, neutral protease and trypsin ratio 1∶2∶3,temperature 50℃,time 4.5 h.Under the optimized condition,the enzymatic hydrolysis yield was 86.76%,soy oligopeptides content was 93.49%,and the bitterness value was significantly lower than single enzyme hydrolysis product.

soybean oligopeptides;enzyme hydrolysis yield;bitterness value

TS201.2

A

0254-5071（2014）04-0087-03

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.021

2014-02-28

遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊項目（2008T009）

谷宇（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品資源開發(fā)與利用。*

蘆明春（1956-），男，教授，本科，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工。