葡聚糖酶產生菌的誘變選育

郭成栓

（廣東食品藥品職業學院生物技術學院，廣東廣州510520）

葡聚糖酶產生菌的誘變選育

郭成栓

（廣東食品藥品職業學院生物技術學院，廣東廣州510520）

利用紫外線誘變育種方法分離對前期分離到一株葡聚糖酶野生菌株P5進行誘變。通過平板初篩、搖瓶復篩，從誘變菌株中篩選出一株高產菌株，其發酵酶活力可以達到5.85U/mL；在此基礎上，對誘變菌株的發酵產酶工藝進行了初步的優化，其最適碳源為淀粉，最適氮源為花生餅粉，正交試驗結果表明，淀粉含量為5%、花生餅粉含量為4%、NaH2PO4含量為0.2%時，該菌株的產酶量最高，酶活力達到21.23U/mL。

枯草芽孢桿菌；葡聚糖酶；酶活力；誘變；突變株

狹義的葡聚糖酶特指內切β-1,3-1,4-葡聚糖酶，是一種重要的工業用酶，在生產生活中廣泛應用于釀造、飼料、食品、紡織等諸多行業[1-6]。β-1,3-1,4-葡聚糖酶的主要來源為微生物[7-12]，包括細菌、真菌、放線菌等，其中芽孢桿菌是產生葡聚糖酶的一種主要菌種，在生產生活中具有較大的研究價值。

葡聚糖酶的酶活性低是影響生產應用的一大瓶頸，因此往往要對野生菌株進行選育。近來，雖然基因工程等育種方法在微生物育種工作中發揮著越來越大的作用[13-14]，但是，傳統的誘變育種在大多數工業微生物育種中仍占有重要的地位[15-16]。從自然界篩選β-1,3-1,4葡聚糖酶高產菌株，對其進行誘變育種并從中篩選產酶活力高的突變株仍是對其進行應用研究的常用方法和途徑。

微生物的代謝過程受到培養基及培養條件的影響，要利用微生物發酵生產該酶，優化其發酵產酶的工藝條件，對于其生產應用也非常關鍵，國內外[8，10，12]也開展了相關的研究工作。因此本研究以前期篩選獲得的具有較高葡聚糖酶活力的枯草芽孢桿菌P5為試驗菌株，對其進行紫外線誘變育種，通過誘變篩選，以獲得葡聚糖酶產量提高的正向突變株，在此基礎上初步研究該突變菌株的產酶條件，以為葡聚糖酶的生產及應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌P5：前期分離得到[17]。

1.1.2 培養基

種子培養基：0.5%牛肉膏、1%蛋白胨、0.5%酵母膏，pH=7.0，121℃滅菌20min。

發酵培養基：0.5%葡聚糖、0.5%牛肉膏、1%蛋白胨、0.5%酵母膏，pH=7.0，121℃滅菌20min。

篩選培養基：0.5%葡聚糖、1%蛋白胨、0.5%酵母膏、0.004mg/mL剛果紅、2%瓊脂，pH=7.0，121℃滅菌20min。

1.1.3 試劑

10mg/mL的葡萄糖溶液：稱取無水葡萄糖1.0g定容至100mL。

0.05 mol/L檸檬酸緩沖液，pH=4.8緩沖溶液的配制[1]。

1.0 %的葡聚糖底物：稱取β-葡聚糖1.000 0g溶于100mL 0.05mol/L的酸性緩沖液中，磁力攪拌至完全溶解（室溫條件下3h以上）。標記為1.0%β-葡聚糖酸性溶液，同時標記pH=4.80、4℃保存。

DNS試劑：10g 3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS），置于600mL水中，逐漸加入20g NaOH，在50℃水浴中攪拌溶解，再依次加入200g酒石酸鉀鈉，5g苯酚和5g無水亞硫酸鈉，待全部溶解后，冷卻至室溫，用水定容至1 000mL。貯存于棕色瓶中暗處放置7d后使用。

1.2 儀器與設備

QYC200全溫度恒溫培養搖床：上海福瑪實驗設備有限公司；UV-2012 PC型紫外可見分光光度計：上海達平儀器有限公司；SW-CJ型凈化工作臺：蘇州凈化設備公司；eppendof 5810高速冷凍離心機：艾本德中國有限公司；DHP-9052恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海中安醫療器械廠；YXK.SJ41.280A高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 紫外誘變方法

菌懸液的制備：用無菌生理鹽水洗下營養瓊脂培養基上枯草芽孢桿菌，振蕩使菌體分散均勻，經血球計數板計數后，調整菌體數量約為106個/mL，備用。

紫外誘變處理：將菌懸液用無菌生理鹽水稀釋至106個/mL，移至無菌平皿中，置于磁力攪拌器上，在15W紫外燈下距離30cm處進行誘變處理。將未經誘變處理及誘變處理后的菌懸液各取0.1mL分別涂布于初篩培養基上，37℃暗室培養2d，計算致死率，以致死率70%～90%為最佳誘變時間。

1.3.2 篩選方法

平板初篩：待初篩培養基上長出菌落后，挑選菌落水解圈直徑和菌落直徑比值（HC值）相對較大的菌落轉接到斜面培養基上，以待進一步復篩。

搖瓶復篩：將平板初篩獲得的菌株接種至液體產酶培養基中，37℃、200r/min振蕩培養2d，測定發酵液的酶活力。

1.3.3 發酵工藝的初步優化

碳源對產酶的影響：以1%（w/v）蛋白胨分作為氮源，碳源分別采用1%（w/v）的葡聚糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉作為碳源，考察不同碳源對葡聚糖酶活力的影響。

氮源對產酶的影響：以1%（w/v）的可溶性淀粉作碳源，分別采用1%（w/v）的酵母粉、蛋白胨、大豆餅粉、花生餅粉、硫酸銨作為氮源，考察不同氮源對葡聚糖酶活力的影響。

無機鹽對產酶的影響：在只含碳源、氮源的培養基中，分別添加0.1%（w/v）的CaCl2、MgSO4、NH4Cl、NaH2PO4、KH2PO4、ZnSO4，考察不同無機鹽對葡聚糖酶活力的影響。

碳源及氮源正交試驗優化：以淀粉、花生餅粉、NaH2PO4作為3因素，采用3水平正交試驗：淀粉（3.0%、4.0%、5.0%）、大豆餅粉（3.0%、4.0%、5.0%），NaH2PO4（0.1%、0.2%、0.3%）培養基裝量為50mL，自然pH值，接種量體積分數為5%，37℃、200r/min發酵48h，測定酶活力。

1.3.4 葡聚糖酶酶活力測定[17]和定義

酶活定義：在試驗條件下，每分鐘分解β-葡聚糖產生相當于1μmol還原糖（以葡萄糖計）所需的酶蛋白的量定義為1個酶活單位（U/mL）。

2 結果與分析

2.1 紫外線誘變時間的選擇

將出發菌株分別置于紫外燈下照射30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s，然后將誘變菌株及出發菌株稀釋到合適的濃度，涂布于葡聚糖篩選平板上，分別計數出發菌株及誘變菌株的菌落數，計算不同照射時間的致死率結果見圖1。由圖1可知，紫外線照射180s時，菌株的致死率達到80%，所以選擇180s作為出發菌株的誘變時間。

圖1 出發菌株的紫外誘變曲線Fig.1 UV mutation curve of original strain

2.2 葡聚糖酶高產菌株的初步篩選

表1 初篩出發菌株與突變菌株的比較Table 1 Comparison of preliminary screening original strain and mutant strain

將紫外線誘變后的枯草芽孢桿菌涂布在葡聚糖平板上面，37℃暗室培養2d，測量葡聚糖平板上菌落水解圈直徑以及菌落直徑，挑選菌落水解圈直徑與菌落直徑比值（HC值）較大的單菌落，葡聚糖平板上面挑選出5株比值較大的菌落（見表1）。從表1可以看出，從突變株Tb3的HC值最大，是出發菌株的1.62倍，初步判斷具有較高的產酶能力，這也說明，從紫外線誘變的突變株中篩選出了少數發生了正向突變的突變株，至于在液體培養基中他們發酵產酶的能力如何，還有待進一步搖瓶復篩進行驗證，所以將篩選出的5株HC值較大的菌落接種到斜面上保存，以供進一步進行搖瓶復篩。

2.3 葡聚糖酶高產菌株的復篩

將初篩得到的5株水解圈直徑/菌落直徑比值較大的菌株接種到搖瓶中，置于搖床上37℃振蕩培養2d，發酵液離心，取上清液，測定酶活力，結果見表2。由表2可知，在初篩出來的5株突變株中，Tb3菌株的葡聚糖酶活力最高，達到5.28U/mL，其他幾株突變株的酶活力大于初始菌株，這說明初篩得到的幾株HC比值較大的菌株在液體培養基中也具有較高的產酶能力，與初篩結果基本吻合。在該試驗中對于出發菌株只是使用了一種誘變劑進行了一輪誘變，初始菌株的產酶能力得到了一定程度的提高，但是提高的幅度有限，所以在后續研究中，可以采用復合誘變劑進行多輪誘變，該菌株產酶的能力會得到進一步提高[18-19]。

表2 復篩出發菌株與突變菌株葡聚糖酶活力的比較Table 2 Glucanase activity comparison of secondary screening strain and mutant strain

2.4 碳源對產酶的影響

碳源對產酶的影響試驗結果如圖2所示。由圖2可知，碳源中，葡聚糖誘導產酶的活性最高，其次是可溶性淀粉，兩者差別不大，考慮到工業生產成本，碳源采用可溶性淀粉，因為其原料廣泛，成本低廉。當碳源采用1%的可溶性淀粉時，酶活力可以達到7.52U/mL。

圖2 碳源對產酶的影響Fig.2 Effect of carbon source on glucanase production

2.5 氮源對產酶的影響

氮源對產酶的影響試驗結果如圖3所示。由圖3可知，氮源中，花生餅粉的產酶效果最好，其次為大豆餅粉、蛋白胨，而無機氮源硫酸銨則產酶量比較低。花生餅粉作為榨油的副產品，來源廣，價格低廉，當氮源采用1%的花生餅粉時，酶活力可以達到10.28U/mL，這對其進行工業化生產是非常有利的。

圖3 氮源對產酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on glucanase production

2.6 無機鹽對產酶的影響

無機鹽一方面是微生物生長所必需的營養物質，同時又可以起到調控滲透壓的的作用，對微生物的生命活動及酶活性的調控具有重要的作用。從圖4可以看出，培養基中添加的各種無機鹽對酶活力的影響，其中添加NaH2PO4后，葡聚糖酶活力最高，達到12.50U/mL。這可能是因為NaH2PO4中的磷可能是葡聚糖合成過程中所需酶或輔酶的組成元素，因此對葡聚糖酶的合成具有重要的影響，同時NaH2PO4中的鈉離子可能對葡聚糖酶的生產也具有一定的促進作用。

圖4 無機鹽對產酶的影響Fig.4 Effect of different inorganic salts on production of glucanase

2.7 培養基優化正交試驗

在單因素試驗中，篩選出了最優碳源、氮源及無機鹽，所以分別以最優碳源（淀粉）、氮源（花生餅粉）、無機鹽（NaH2PO4）作為影響因素，進一步探討各因素不同水平對枯草芽孢桿菌產葡聚糖酶的影響，進行正交試驗，試驗結果見表3。

由表3可知，從R值大小可以看出，葡聚糖酶產酶量影響因素大小為可溶性淀粉>花生餅粉>NaH2PO4，可溶性淀粉對葡聚糖酶生產的影響最大，在3因素中極差最明顯。從K值大小可以得到發酵最適水平組合為A3B2C2，即可溶性淀粉5.0%、花生餅粉4.0%及NaH2PO40.2%，但是這一方案未包含在正交試驗方案中，因此將試驗菌株接種在該組合培養基中進行酶活力驗證試驗，酶活力測定結果表明該培養基條件發酵產酶的活力可以達到21.23U/mL。

表3 培養基配方優化正交試驗結果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for mediumformula optimization

在該項研究中對發酵產酶進行了一個初步的優化，只是對發酵產酶的單一碳源及氮源進行了優化，實際上，在發酵過程中，不同的碳氮源之間有時具有互補效應，因此采用復合碳氮源有時反而會提高產酶的能力[20]，所以后續研究中，可以進一步對該菌株發酵產酶的復合碳源及氮源進行優化，同時進行更多因素更多水平的優化，從而得到更優的培養基配方，進而提高該菌株發酵產酶的能力，為利用該菌株發酵進行酶的生產及應用奠定堅實基礎。

3 結論

3.1 利用紫外線誘變育種方法，對從土壤中篩選出的一株葡聚糖酶高產菌株進行了誘變育種，利用葡聚糖平板初篩，從突變菌株中篩選出了5株HC值較大的菌株，然后將5株突變菌株接入搖瓶進行復篩，結果從5株突變菌株中篩選出一株葡聚糖酶高產菌株Tb3，其搖瓶發酵酶活力達到5.28U/mL，其他4株突變株的酶活力也得到了一定程度的提高。

3.2 對枯草芽孢桿菌菌株Tb3液體發酵條件產酶的條件進行了初步的研究，初步研究結果表明，該菌株液體發酵產酶的最適碳源為可溶性淀粉，最適氮源為花生餅粉。在此基礎上對最適碳源、最適氮源以及無機鹽進行了3因素3水平的正交試驗，結果表明，可溶性淀粉對葡聚糖酶生產的影響最大。當最適碳源可溶性淀粉含量為5.0%，最適氮源花生餅粉含量為4.0%，無機鹽NaH2PO4含量為0.2%時，其發酵酶活力最高，達到21.23U/mL。

[1]YANG S,QIAO J Y,JIANG Z,et al.Biochemical characterization of a novel thermostable beta-1,3-l,4-glucanase fromPaecilomyces thermophila[J].J Agr Food Chem,2008,56(13):5345-5351.

[2]韓晶，李寶坤，李開雄，等.β-葡聚糖酶的特性與應用研究[J].中國釀造，2008，27（17）：4-7.

[3]畢靜.β-葡聚糖酶及其在啤酒生產中的應用[J].中國釀造，2011，30（9）：105-106.

[4]李永仙，顧國賢，俞中.耐高溫β-葡聚糖酶在啤酒糖化中的應用研究[J].釀酒，2002，29（2）：81-83.

[5]許梓榮，錢利純，孫建義.高麥麩飼糧中添β-葡聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶對肉雞作用效果的研究[J].動物營養學報，2000（1）61-63.

[6]Thaker，于旭華.β-葡聚糖酶與木聚糖酶在豬飼料中的應用[J].中國畜牧獸醫，2002（3）：17-20.

[7]TENG D,WANG J H,FAN Y,et al.Cloning ofβ-1,3-1,4-glucanase gene fromBacillus licheniformisEGW039(CGMCC 0635)and its expression inEscherichia coliBL21(DE3)[J].Appl Microbiol Biot,2006,72(4): 705-712.

[8]TANG X J,HE G Q,CHEN Q H,et al.Medium optimization for the production of thermal stableβ-glucanase byBacillus subtilisZJF-1A5 using response surface methodology[J].Bioresource Technol,2003,93(2): 175-181.

[9]TANG Y B,YANG S Q,YAN Q J,et al.Purification and characterization of a novelβ-1,3-1,4-glucanase(lichenase)from thermophilicRhizomucor mieheiwith high specific activity and its gene sequence[J].J Agr Food Chem,2012,60(9):2354-2361.

[10]郝秋娟，李永仙，李琦，等.淀粉液化芽孢桿菌5582產β-葡聚糖酶的發酵條件和酶學性質研究[J].食品工業科技，2006，27（8）：149-153.

[11]PLANAS A.Bacterialβ-1,3-1,4-glucanase:structure,function and protein engineering[J].BBA-Protein Struct M,2000,1543(2):361-382.

[12]白曉娟，王聞曉.響應面法優化Bacillus subtilisAS35產β-葡聚糖酶發酵培養基的研究[J].農產品加工，2011（8）：76-80.

[13]BALTZ R H.Genetic manipulation of antibiotic-producingStreptomyces[J].Trends Microbiol,1998,6(2):76-83.

[14]BUTLER M J,TAKANO E,BMHEIM P,et al.Deletion of scbA enhances antibiotic production inStreptomyces lividans[J].Appl Microbiol Biot,2003,61(5-6):512-516.

[15]雷肇祖，錢志良，章健.工業菌種選育述評[J].工業微生物，2004，34（1）：39-5l.

[16]PAREKH S,VINCI V A,STROBEL R J.Improvement of microbial strains and fermentation processes[J].Appl Microbiol Biot,2000,54 (3):287-301.

[17]郭成栓.一株葡聚糖酶產生菌的分離選育及鑒定[J].中國釀造，2012，31（9）：95-97.

[18]張瑩，郭琛琛，黑東燕，等.復合誘變法選育谷氨酰胺轉胺酶高產菌株及高產菌株產酶特點[J].食品科學，2013，34（11）：1-7.

[19]郝林.食品微生物學實驗技術[M].北京：中國農業出版社，2006.

[20]張素敏，陳彩芳，葉秀云，等.內切葡聚糖酶高產菌株的誘變選育[J]. 2013，40（8）：1448-1456.

Mutation breeding of high glucanase producing strain

GUO Chengshuan
（College of Biotechnology,Guangdong Food and Drug Vocational Institute,Guangzhou 510520,China）

UV mutation breeding method was used to mutate a glucanase-producing wild strain P5 isolated in earlier stage.A high glucanase-producing strain was screened by plate screening and shaking flask culture with glucanase activity of 5.85 U/ml.Furthermore,the fermentation medium of mutant strain was optimized,and the optimum carbon source and nitrogen source was starch and peanut meal,respectively.The optimum medium formula was determined as follows:soluble starch 5%,peanut meal 4%,NaH2PO40.2%.Under these conditions,the fermentation glucanase activity reached up to 21.23 U/ml.

Bacillus subtilis;glucanase;enzyme activity;mutation;mutant strain

TS201.3

A

0254-5071（2014）04-0090-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.022

2014-02-28

2013年建設中醫藥強省科研項目（20131277）；廣東食品藥品職業學院自然科學青年基金項目（2009YZ005）

郭成栓（1977-），男，講師，博士，主要從事發酵工程、酶工程的研究工作。