四川冬菜中苯乳酸高產菌株的分離與鑒定

鄧林

（四川工商職業技術學院酒類與食品工程系，四川都江堰611830）

四川冬菜中苯乳酸高產菌株的分離與鑒定

鄧林

（四川工商職業技術學院酒類與食品工程系，四川都江堰611830）

通過雙層平板拮抗法和牛津杯瓊脂擴散法抑菌試驗，從傳統發酵食品四川冬菜中分離篩選得到18株乳酸菌。結合反相高效液相色譜法得到1株苯乳酸高產菌株DL-13，其發酵上清液中苯乳酸含量為143mg/L。結合菌落形態、細胞形態、生理生化特性，最終確定菌株DL-13為植物乳桿菌。

四川冬菜；苯乳酸；篩選；鑒定

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA）即2-羥基-3-苯基丙酸[1-2]，是近年來新發現的一種天然抑菌化合物，在食品生產中可作為新型生物防腐劑使用，具有較好的抑菌譜、溶解性和穩定性[3]。很多微生物如乳酸菌（Lactobacillus）[4]、白地霉（Geotrichum candidum）[2]、紅球菌（Rhodococcus）[5]和丙酸霉（Propionic acid mildew）[6]都能產生苯乳酸。乳酸菌是公認為安全（generally recognized as safe，GRAS）的微生物，近年來研究的熱點轉為通過乳酸菌發酵生產苯乳酸[7-9]。2000年，LAVERMICOCCA P等[1]首次報道從酸面團中分離到的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）21B，苯乳酸產量達到56.44mg/L。隨后研究相繼獲得多株產苯乳酸的乳酸菌，但菌株間產量差異較大，且苯乳酸產量相對都較低[4，10]。要實現微生物工業化發酵生產苯乳酸，必須要有高產苯乳酸的菌種來源，所以苯乳酸生產菌的篩選具有重要的研究價值和意義。

四川冬菜是一種半干態發酵性腌制品，細嫩味鮮，香氣濃郁，是四川人常食用的一種傳統發酵食品[11]。本研究選用四川冬菜作為乳酸菌資源，通過雙層平板拮抗法和牛津杯瓊脂擴散法的初篩試驗，再結合反相液相色譜法檢測發酵液中苯乳酸含量，分離篩選出1株高產苯乳酸的乳酸菌菌株，并對菌株進行了初步鑒定，以期為進一步的菌種馴化選育及工業化發酵生產苯乳酸奠定理論基礎，為其在食品工業中的應用提供菌種來源，也能為四川冬菜中發酵微生物菌群的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗樣品

四川冬菜：四川工商職業技術學院食品生物技術實驗室自制。

1.1.2 主要試劑

苯乳酸：美國Sigma公司。其他試劑均為分析純：成都金山化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基

乳酸細菌培養基（MRS）：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，葡萄糖20.0g，吐溫-80 1.0mL，乙酸鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，瓊脂18.0g，蒸餾水1 000mL，pH 6.2～6.6。

LB培養基：胰蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，氯化鈉10.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1 000mL，pH7.0。

初篩培養基：在MRS培養基中添加質量分數為3%的碳酸鈣和0.1%山梨酸鉀。

發酵培養基：液體MRS培養基。

1.2 儀器與設備

FA 2004型電子分析天平：上海精密儀器有限公司；LRH-250型生化培養箱：上海齊欣科學儀器有限公司；奧林巴斯生物顯微鏡：日本奧林巴斯公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀、Agilent Zorbax SB-C18 USP L1分析柱（4.6mm×150mm，5μm）：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離篩選試驗設計

1.3.2 乳酸菌的分離

將10g于組織搗碎機中粉碎后的四川冬菜倒入三角瓶中，加200mL蒸餾水，充分振蕩。取1mL冬菜處理液分別接種于苯乳酸含量為1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL的初篩培養基中，37℃富集培養24h。采用常規平板梯度稀釋法進行初篩，挑選有碳酸鈣溶解圈的單菌落進行鏡檢[11-12]。將單菌落平板劃線進行純化培養，反復3次。挑取單菌落轉接于斜面MRS培養基上，37℃培養24h后放入冰箱，4℃保存備用。

1.3.3 初篩方法

雙層平板拮抗法：指示菌為金黃色葡萄球菌。平板下層為固體MRS培養基，受試菌于下層培養基上劃線后，置于恒溫培養箱中37℃培養48h。然后傾注10mL半固體LB培養基于平板上層。將金黃色葡萄球菌配成濃度為106CFU/mL的菌懸液，均勻涂布于上層培養基，37℃培養24h，觀察抑菌情況[13]。

牛津杯瓊脂擴散法抑菌試驗：取發酵液于100℃保溫20min后，5 000r/min離心15min。取上清液調節pH值至5，進行抑菌試驗。

游標卡尺十字交叉法測量抑菌圈直徑：以抑菌圈直徑（cm）為指標，重復3次，取平均值作為結果。

1.3.4 復篩方法

將菌株以5%接種量接種于發酵培養基中，37℃培養36h。得到的發酵液經過5 000r/min離心15min后取上清液，使用反相高效液相色譜法測定苯乳酸的含量，篩選出苯乳酸高產菌株。

反相高效液相色譜法條件為：流動相A為0.5g/L三氟乙酸溶液，B為乙腈溶液，洗脫程序是：0～20min為10%～100%B，20～23min保持100%B，流速1mL/min。檢測波長為210nm，柱溫30℃，進樣量10μL[14-15]。

1.3.5 苯乳酸標準曲線的繪制

稱取0.300 0g苯乳酸標準品，溶于0.1%磷酸緩沖液（pH2.5），定容至10mL。稀釋苯乳酸溶液質量濃度分別為60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/L、180mg/L。用0.45μm膜過濾各質量濃度的標準品溶液后用反相高效液相色譜法測定。

2 結果與分析

2.1 標準曲線回歸方程的建立

以峰面積A（y）對苯乳酸標準液質量濃度（x）作標準曲線，得到苯乳酸標準曲線見圖1。

圖1 苯乳酸的標準曲線Fig.1 Standard curve of phenyllactic acid

2.2 四川冬菜中產苯乳酸菌株的分離篩選

2.2.1 出發菌株對苯乳酸耐受力

出發菌株于液體MRS培養基中培養時對苯乳酸的耐受力結果見表1。

表1 出發菌株對苯乳酸的耐受力Table 1 Tolerance of original strain to phenyl-lactic acid

菌株對產物的耐受力與產物存在沒有必然的聯系，而與菌株個體特性相關。但在培養基中添加適當濃度的產物，較容易篩選出產量較高且對產物耐受力較強的菌株[16]。由表1可知，當苯乳酸質量濃度由1mg/mL逐漸增加至3mg/mL時，菌株生長良好，當苯乳酸質量濃度為4mg/mL時，出發菌株長勢較弱，且當苯乳酸質量濃度高于5mg/mL時菌株不能正常生長。因此以4mg/mL作為苯乳酸高產菌株的初篩濃度。

2.2.2 初篩結果

用四川冬菜處理液進行碳酸鈣溶解圈試驗，篩選得到菌株128株。雙層平板拮抗法篩選結果見圖2，可知受試菌株對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。牛津杯瓊脂擴散法抑菌試驗結果見圖3，抑菌圈直徑為28mm，可見發酵液對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。選擇抑菌圈直徑≥25mm的菌株進行下一步試驗，得到菌株18株。

圖2 雙層平板拮抗法篩選結果Fig.2 Screening result of antibacterial test by double plate antagonistic method

圖3 牛津杯瓊脂擴散法抑菌試驗篩選結果Fig.2 Screening result of antibacterial test by Oxford cup agar diffusion method

2.2.3 反相高效液相色譜測定結果

圖4 苯乳酸標樣(A)及菌株DL-13發酵上清液(B)的HPLC圖譜Fig.4 Chromatograms of phenyllactic acid standard(A)and strain DL-13 fermentation supernatant(B)

反相高效液相色譜測定結果顯示，18株菌株的發酵上清液都出現了苯乳酸色譜峰，表示其都具有通過自身代謝發酵產苯乳酸的能力，其中有8株菌的發酵產物中苯乳酸含量在80mg/L以上，菌株DL-13發酵液中苯乳酸含量最高，達到143mg/L。苯乳酸標樣和菌株DL-13發酵上清液反相高效液相圖譜見圖4。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 形態學鑒定

將獲得的高產菌株DL-13接種于MRS固體培養基上，37℃恒溫培養48h，觀察菌落形態。挑取單菌落進行革蘭氏染色，芽胞染色，鞭毛染色，并在顯微鏡下觀察菌體形態[17]。

菌株DL-13在MRS固體培養基上培養時菌落突起，圓形，邊緣整齊，光滑，濕潤，灰白色。在含3%碳酸鈣的MRS固體培養基上形成明顯的透明圈。

菌株DL-13為革蘭氏陽性短桿狀細胞，單個、成對或形成短鏈，大小為（0.5～1.0）mm×0.5mm，無芽胞，不具運動性。

2.3.2 生理生化特性鑒定

對菌株DL-13進行硝酸鹽還原試驗，乙酰基甲醇（Voges-Proskauer，VP）試驗，甲基紅（methy red，MR）試驗，糖發酵試驗等，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及試驗方法》，進行鑒定。生理生化特性結果見表2。

表2 菌株DL-13的生理生化特性Table 2 Biochemical and physiological characteristics of strain DL-13

根據形態學特征、生理生化特性結果，對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《乳酸細菌分類鑒定及試驗方法》，由表2結果，將DL-13菌株鑒定為植物乳桿菌，并命名為Lactobacillus plantarumDL-13。

3 結論

四川省傳統發酵食品冬菜是一種半干態發酵性腌制品，在發酵的過程中涉及到多種微生物的聯合協同作用。對四川冬菜中的發酵微生物菌群進行了研究，在菌種初篩時添加一定質量濃度的苯乳酸，通過雙層平板拮抗法結合牛津杯瓊脂擴散法抑菌試驗，分離篩選得到了一株高產苯乳酸的菌株DL-13。對其發酵上清液進行反相液相色譜測定，其苯乳酸含量為143mg/L。

通過形態學、生理生化鑒定分析，初步鑒定分離得到的高產苯乳酸的菌株DL-13為植物乳桿菌，命名為Lactobacillus plantarumDL-13。

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Isolation and identification of phenyl-lactic acid high-yield strains in Sichuan preserved vegetable

DENG Lin
(Department of Alcoholic Drink and Food Engineering,Sichuan Technology and Business College,Dujiangyan 611830,China)

By double plate antagonistic method and Oxford cup agar diffusion method of antibacterial test,18 strains of lactic acid bacteria from Sichuan preserved vegetable which could produce phenyl-lactic acid during fermentation were obtained.Results of reserved phase HPLC showed that mass concentration of phenyl-lactic acid in the culture medium supernatant of strain DL-13 was 143 mg/L.Combining with morphological,biochemistry and physiological test,strain DL-13 was identified asLactobacillus plantarum.

Sichuan preserved vegetable;phenyl-latic acid;isolation;identification

TS 255.54

A

0254-5071（2014）04-0097-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.024

2013-12-17

四川省教育廳課題（13ZB0364）

鄧林（1977-），女，副教授，碩士，研究方向為食品生物技術。