玉米秸稈水解液發酵產琥珀酸的條件優化研究

謝慧，張兆昆，吳瓊，王風芹，任天寶，宋安東*

（1.河南農業大學生命科學學院，河南鄭州450002；2.河南農業大學煙草學院，河南鄭州450002）

玉米秸稈水解液發酵產琥珀酸的條件優化研究

謝慧1，張兆昆1，吳瓊1，王風芹1，任天寶2，宋安東1*

（1.河南農業大學生命科學學院，河南鄭州450002；2.河南農業大學煙草學院，河南鄭州450002）

以玉米秸稈水解液為原料，對一株產琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）ATCC 55618的發酵條件進行優化，研究了培養溫度、發酵培養基的初始pH以及培養基成分對該菌株產琥珀酸發酵的影響，并利用響應面法（RSM）對發酵培養基中的水解糖、玉米漿和Na2CO3添加量3個主要因素進行優化，經過優化后的發酵條件為培養溫度37℃、培養基初始pH6.8；水解糖質量濃度60g/L、玉米漿質量濃度10g/L、Na2CO3（10mol/L）添加量2mL。在1L的厭氧甁中進行了分批發酵放大實驗，琥珀酸產量最高達19.66g/L。

玉米秸稈；水解液；琥珀酸；條件優化；響應面法

琥珀酸學名丁二酸，是一種廣泛存在于人體、動植物和微生物體內常見的天然有機酸。琥珀酸是三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA）的中間產物之一，在生物的代謝中占有非常重要的地位，因此被廣泛用于化學藥物的中間體[1]。琥珀酸也被公認為將是繼檸檬酸和乳酸后的下一個大規模生產的有機酸產品[2]。傳統的琥珀酸生產方法主要是依賴化石原料通過化學過程來合成琥珀酸。然而，隨著能源危機的日益嚴重，新興的發酵法生產琥珀酸以其低能耗、高環保性和原料的可持續利用性而受到越來越多科學家的重視。

我國擁有豐富的植物纖維資源（如農作物秸稈、林產品加工業下腳料等），每年僅玉米秸稈一項就超過1.7億t[3]。每年浪費或低利用的纖維材料總共約10億t，其中農作物秸稈一項大約7億t[4]，這些纖維質原料（如玉米秸稈、玉米籽皮、玉米芯等）可以利用物理或化學的預處理方法破壞纖維質原料的內部結構降低其聚合度；再加入水解酶或能產生水解酶的微生物使纖維質原料轉化為低分子糖類如葡萄糖和木糖等，最后利用微生物發酵大規模的轉化制備琥珀酸等生物基化工產品，產業前景十分廣闊[5]。因此，利用農作物秸稈水解液作碳源制備琥珀酸，將有效減少琥珀酸發酵對淀粉原料的依賴性，緩解當前面臨的糧食危機問題，并可降低原料成本[6]。

目前，琥珀酸發酵的研究主要集中在菌種選育和代謝調控等方面。關于琥珀酸發酵條件優化方面的研究較少，尤其是以纖維水解液為原料發酵產琥珀酸的條件研究則更少，因此，本研究也為實現以農作物秸稈水解液為原料發酵生產琥珀酸的產業化提供一定的參考條件和技術支撐。文中研究利用水解糖質量濃度為39.99g/L（葡萄糖質量濃度為19.07g/L、木糖質量濃度為20.82g/L）的玉米秸稈水解液作原料，在300mL厭氧甁中對一株產琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）ATCC 55618首先進行了培養溫度、發酵培養基初始pH值及發酵培養及成分的條件優化；為進一步提高琥珀酸產量，又利用響應面法優化琥珀酸發酵培養基中的3個主要因素；并利用優化后的發酵條件在1L的厭氧甁中進行分批發酵放大試驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

玉米秸稈：取自河南省新鄉，粉碎至10目，經檢測其成分為纖維素32.56%，半纖維素20.64%，木質素11.95%，水分4.41%，灰分3.22%[17]。

1.1.2 試劑

纖維素酶（濾紙酶活260U/mL）和木聚糖酶（10 000U/mL）：杰能科（中國）生物工程有限公司；酵母膏、玉米漿均為工業級；發酵試驗所用的試劑均為市售色譜純或分析純。

1.1.3 菌種

菌種：產琥珀酸放線桿菌（A.succinogenes），保存號ATCC 55618，購自中國工業菌種保藏中心（CICC）。

1.1.4 培養基

種子培養基：葡萄糖2.5g、K2HPO4·3H2O 2.5g、胰蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、NaCl 5g、pH 7.0加水定容至1L。

發酵培養基：玉米秸稈水解液（水解糖質量濃度為40g/L）、玉米漿15g/L、富馬酸二鈉1g/L、K2HPO43g/L、NaCl 1g/L、MgCl20.2g/L、CaCl20.2g/L、NaH2PO4·H2O 1.6g/L、Na2HPO40.31g/L[6]。

1.2 儀器與設備

JYS-1000全自動高壓蒸氣滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；722S可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；P680 HPLC高效液相色譜儀：美國戴安公司；Aminex HPX-87H色譜柱：美國Bio-Red公司。

1.3 方法

1.3.1 培養方法

將處于生長對數期的種子液以5%的接種量在厭氧條件下接入裝有90mL培養基的300mL厭氧甁中，再充入250mLCO2（純度99.99%）氣體，并用封口膜密封保證厭氧環境，置于37℃搖床中150r/min培養。

1.3.2 檢測方法

發酵液在室溫條件下10 000r/min離心10min，取上清，用孔徑為0.22μm的無菌濾膜過濾。利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測發酵底物與產物含量，色譜柱為HPX-87H（美國Bio-Red公司），流動相為5mmol/L的H2SO4溶液，流速為0.6mL/min，柱溫55℃，進樣量10μL，檢測器為視差折光（refractive index，RI）檢測器。菌體密度利用可見分光光度計于波長660nm處測定其吸光度值。結果均為平行測定3次后的平均值。

2 結果與分析

2.1 發酵環境條件優化

2.1.1 培養溫度對琥珀酸發酵的影響

溫度對細胞生長和產物合成過程具有重要影響，而且細胞生長和產物合成的最適溫度不一定相同，因此，在發酵過程中需要選擇合適的培養溫度，分別在33℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃條件下進行培養，結果如圖1所示。

圖1 培養溫度對菌體生長和產酸的影響Fig.1 Effect of incubation temperature on cell growth and succinate production

由圖1可知，當培養溫度低于37℃時，琥珀酸的產量隨溫度升高而升高，當培養溫度高于37℃，琥珀酸的產量隨溫度的升高而減小。當培養溫度為37℃時，菌體OD660nm最高，琥珀酸產量也達到最高8.42g/L，37℃是適宜的培養溫度。

2.1.2 培養基的初始pH對琥珀酸發酵的影響

城市交通智能化發展必須要遵循現有的城市化交通發展戰略，頂層的設計是城市交通朝向智能化發展的關鍵環節，頂層的設計是解決城市智能化發展的首要目標和重要任務[4]。因此，城市交通智能化發展在大數據時代下首先要充分利用互聯網等最新信息技術，以人工智能、綜合感知和普適計算作為支撐基點，實現城市發展和城市智能交通的雙面結合，對人群所需和其他活動于物流做出智能反應，保障城市平衡發展。另外，還要尋求理論與技術創新使用于一體，主要著眼于建設決策者、系統服務對象等其他交通參與者的設定，并且對各類主體參與者的特征和參與者的空間分布進行有效性研究，達到城市空間與智能交通運營相互關聯。

微生物生長和生物合成都有其最適pH和能夠耐受的pH范圍。過高或過低的pH還會影響菌體的形態，同時對某些微生物的合成代謝途徑也有一定影響，從而影響發酵效果。因此，選擇合適的發酵培養基的初始pH值對產琥珀酸放線桿菌發酵產琥珀酸至關重要。用pH值為5.8和7.9，濃度為0.2mol/L的磷酸緩沖液將發酵培養基的pH值分別設定6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4六個水平來進行發酵培養，考察不同培養基初始pH對琥珀酸發酵的影響，結果如圖2所示。

圖2 初始pH對菌體生長和產酸的影響Fig.2 Effect of initial pH on cell growth and succinate production

由圖2可知，當培養基的初始pH值為6.8時，琥珀酸的產量最高，為8.75g/L，且菌體生長較好，pH過高或過低都會影響琥珀酸的產量。故選擇pH 6.8為培養基的初始pH。

2.2 琥珀酸發酵培養基主要因素優化

2.2.1 水解糖質量濃度對琥珀酸發酵的影響

玉米秸稈水解液中的纖維水解糖是產琥珀酸放線桿菌發酵培養基的主要碳源，因此，其在培養基中的質量濃度非常重要，如果底物水解糖的質量濃度過高，細胞生長會因細胞脫水而下降，并在某一質量濃度下會阻遏1個或更多的影響產物合成的關鍵酶。此外，水解糖的質量濃度也會對琥珀酸的發酵周期產生一定影響。根據目前文獻報道，通常琥珀酸發酵的水解糖濃度一般在40g/L左右，因此，將水解糖質量濃度為70g/L的水解液依次稀釋為20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L和70g/L六個水平，并以此為原料分別發酵產琥珀酸來考察不同水解糖的質量濃度對琥珀酸發酵產量的影響，對比結果如圖3所示。

圖3 不同水解糖質量濃度對菌體生長和產酸的影響Fig.3 Effect of different hydrolyzate concentration on cell growth and succinate production

由圖3可知，當培養基中水解糖質量濃度高于60g/L時，琥珀酸產量減小，說明高于此質量濃度的水解糖對琥珀酸的合成可產生抑制作用，OD660nm值的變化也是如此。而當水解糖質量濃度為60g/L時，琥珀酸產量達到15.84g/L，為水解糖的最佳質量濃度。

2.2.2 玉米漿質量濃度對琥珀酸發酵的影響

玉米漿是產琥珀酸放線桿菌生長所依賴的主要氮源，且具備價格低廉和營養豐富等優點，同時也是工業上常用的有機氮源，在有關琥珀酸發酵的相關文獻報道中，玉米漿的應用也較為廣泛。當玉米漿作為氮源時，若質量濃度過小，會造成菌體生長緩慢，從而影響產物的產率；若質量濃度過大，會造成菌體生長旺盛，使養分過早耗盡，導致菌體提前衰老，從而縮短產物的生產期。因此需要選擇合適的玉米漿質量濃度，分別設定玉米漿的初始添加質量濃度為5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L和30g/L共六個水平發酵產琥珀酸，來考察不同玉米漿添加量對琥珀酸產量的影響，對比結果如圖4所示。

圖4 不同玉米漿質量濃度對菌體生長和產酸的影響Fig.4 Effect of different corn syrup concentration on cell growth and succinate production

由圖4可知，當玉米漿的添加量為10g/L，琥珀酸的產量為最高值8.33g/L。玉米漿的添加量高于或低于10g/L時，琥珀酸的產量會降低。故玉米漿的添加量為10g/L時最合適。

以生物發酵法制備琥珀酸，CO2、pH是影響菌體生長和琥珀酸產量的關鍵因素[7]。CO2在菌體的生長代謝過程中可作碳源被菌體利用，合成琥珀酸。環境pH的改變不僅會引起菌體內外部化學環境和酶活力的變化，對細胞代謝產生影響，而且還可以影響CO2的溶解水平，以及、的解離平衡，進而影響琥珀酸的合成。因此，在琥珀酸發酵過程中維持pH在適宜的范圍，對提高菌體的代謝活性和產琥珀酸能力具有重要作用。

產琥珀酸放線桿菌發酵產琥珀酸過程中產生的有機酸可使pH值明顯下降。為了維持發酵液中的pH在一定范圍內，可加入碳酸鹽作為酸堿中和劑。同時，碳酸鹽還可以提供一定的，并與發酵過程中產生的有機酸反應而釋放出CO2來維持琥珀酸發酵所需的CO2環境。另外，pH調節劑中的金屬陽離子在維持細胞新陳代謝方面起著重要作用。因此，選取添加量2.0mL Na2CO3、NH4HCO3、MgCO3、K2CO3、CaCO3這五種文獻報道較多且應用較廣的碳酸鹽（濃度均為10mol/L）作為pH調節劑。通過在發酵12h、18h、24h、30h產琥珀酸放線桿菌代謝較旺盛的發酵時間點均添加以上5種碳酸鹽，來分別對比考察了這5種不同pH調節劑對琥珀酸產量的影響，結果對比如圖5和圖6所示。

由圖5可知，5種碳酸鹽中Na2CO3的發酵產量最高，NH4HCO3和CaCO3的發酵產量相對較低，這可能是由于細胞膜對有較高的通透性，+的滲入會造成胞內pH水平發生變化，細胞需要更多的能量將泵出，可見，環境中較高濃度會降低細胞對能量的利用效率。當能量供給不足時，受胞內的影響，胞內的pH發生變化，影響細胞正常的生長代謝[8]，同時，由于CaCO3的溶解能力差，因此少量的CaCO3很難將pH維持在適合菌體生長的范圍。同時，已有研究表明，Ca2+對琥珀酸生產菌Mannheimiasucciniciproducens具有毒害作用[9]。同時，高濃度的Ca2+可以改變細胞膜正常的流動性和通透性，致使菌體不能進行正常的胞內外物質能量傳遞，從而影響產琥珀酸放線桿菌的正常生長和代謝。此外，Mg2+在維持細胞新陳代謝方面起著重要作用，Mg2+是許多酶的激活劑，在琥珀酸合成途徑中的關鍵酶（磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶）的輔助因子，對代謝流的分布起著關鍵的作用。因此，琥珀酸產量也整體相對較高。但是MgCO3成本較高，且會增加下游產品分離提取的難度，不利于生物法制備琥珀酸的產業化。

圖5 不同pH調節劑對琥珀酸發酵產量的影響Fig.5 Effect of different pH modifier concentration on succinate production

圖6 不同Na2CO3添加量對琥珀酸發酵產量的影響Fig.6 Effect of different Na2CO3addition on succinate production

由圖6可知，在發酵過程中當培養基的Na2CO3（濃度為10mol/L）添加量為2mL時，琥珀酸產量最高，Na2CO3可以提供CO32-，且可以調節發酵過程的pH，有利于產琥珀酸放線桿菌合成琥珀酸。當Na2CO3添加量過高時，琥珀酸產量有所下降，可能是由于發酵過程中Na+濃度處于較高水平，造成高滲環境。這對菌體有較大的負面作用，使細胞不能正常代謝，最終導致琥珀酸產量的降低。

2.2.4 響應面優化琥珀酸發酵培養基中的主要因素

響應面分析法（response surface methodology，RSM）是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法[10]。利用響應面法優化琥珀酸放線桿菌的發酵培養基也是近幾年來研究的熱點。周彬等[12]通過響應曲面法（RSM）優化琥珀酸放線桿菌培養基組分，得到最優發酵條件葡萄糖質量濃度、酵母膏質量濃度、溫度、培養基初始pH分別為39.1g/L、20.5g/L、37.3℃、7.6，最終，琥珀酸的發酵產量為37.2g/L。楊昆等[13]利用葡萄糖為原料，通過響應面法優化產琥珀酸發酵培養基，最終琥珀酸產量為33.45g/L。

為了提高琥珀酸產量，可采用響應面法優化培養基。考慮到該試驗是優化產琥珀酸的發酵培養基，結合了前期試驗和文獻報道，確定碳源水解糖、氮源玉米漿和培養基中的酸堿中和劑Na2CO3為自變量考察因素，以琥珀酸質量濃度為響應值，以反應過程參數對琥珀酸產量的影響，以及各因素之間的交互作用，確定影響響應值的顯著因素。經過單因素初步優化，確定了3個因素的添加量范圍。對3個顯著因子編碼，各因子設定水平及編碼見表1。

表1 試驗設計因素及編碼水平Table 1 Factors and coding levels of the experiment

為進一步考慮3種因素的交互作用及最佳添加量，采用Box-Behnken中心組合試驗設計，進行3因素3水平試驗。以琥珀酸產量為響應值，試驗設計及結果見表2，利用Design Expert軟件對表2數據進行多元回歸擬合。獲得響應值—琥珀酸質量濃度（Y）對影響琥珀酸質量濃度的顯著因素—水解糖質量濃度（X1）、玉米漿質量濃度（X2）和Na2CO3添加量（X3）的二次多項式回歸模型為Y=19.61+0.62X1+ 0.034X2+0.46X3-0.33X1X2+1.11X1X3+1.51X2X3-1.85X1X1-2.84X2X2-3.45X3X3。

由表3的回歸模型方差分析可知，模型（P值＜0.000 1）是非常顯著的，模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率[11]。而失擬項P值0.317 4＞0.05，模型失擬項不顯著，說明殘差由隨機誤差引起，模型選擇合適。回歸系數R2=0.983 7＞0.9，擬合度＞90%，說明模型相關度很好，可以使用該模型來分析響應值的變化，試驗誤差較小，可用此模型對琥珀酸濃度進行分析和預測。

由表4可知，回歸模型中的一次項X1（水解糖質量濃度，g/L）的P值0.015 1＜0.05，表示影響非常顯著；而X2（玉米漿質量濃度，g/L）的P值0.866 1＞0.05，表示影響不顯著；X3（Na2CO3添加量，mL）的P值為0.048 8，影響較顯著；交互項中X1X3的P值為0.0049，影響非常顯著，X2X3的P值為0.0009，影響也非常顯著，而另外一個交互項X1X2的P值為0.273 3，交互作用不顯著。該結果表明水解糖質量濃度和pH調節劑Na2CO3的添加量對產琥珀酸放線桿菌發酵產琥珀酸的發酵產量影響較明顯，且水解糖質量濃度和pH調節劑Na2CO3的添加量對琥珀酸質量濃度交互作用較明顯。根據系數估計值X1=0.62、X2=0.034和X3=0.46，可知影響因素的顯著性順序為：水解糖質量濃度＞Na2CO3添加量＞玉米漿質量濃度。

表2 響應面法試驗設計與結果Table 2 Design and result of response surface methodology

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of response surface model

表4 回歸模型系數的顯著性檢驗Table 4 Significance test of regression model coefficient

2.2.5 模型交互項的分析

基于二次回歸模型進行響應面及等高線如圖7所示。

圖7 各因素相互作用對琥珀酸產量的影響的響應面圖與等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot of interaction among corn syrup concentration,hydrolyzate concentration and Na2CO3addition on succinate production

由圖7可知，玉米漿質量濃度不變，隨著水解糖質量濃度的增加，琥珀酸產量也呈遞增趨勢，當水解糖質量濃度逐漸接近60g/L時，琥珀酸產量呈遞增趨勢，若水解糖質量濃度持續升高，則琥珀酸產量會逐漸呈下降趨勢，可能原因是由于水解糖質量濃度過高或玉米秸稈水解液中的有毒物質過高從而抑制了產琥珀酸放線桿菌的代謝所致。

由圖7可知，當水解糖質量濃度不變時，Na2CO3添加量逐漸接近2mL時，琥珀酸產量呈遞增趨勢；若Na2CO3添加量繼續增加，則琥珀酸產量會呈下降趨勢。這是由于高濃度的Na2CO3會造成微生物的滲透壓升高，從而抑制微生物代謝，影響琥珀酸的發酵產量。

由圖7可知，當Na2CO3添加量不變時，若玉米漿質量濃度逐漸接近10g/L時，琥珀酸產量呈遞增趨勢；若繼續增加玉米漿質量濃度，琥珀酸的產量則會呈下降趨勢。

基于以上圖7的響應面模型分析可知，響應值存在最大值，經軟件分析計算，得到琥珀酸產量預測值最大時的組分含量：水解糖質量濃度為60g/L，玉米漿質量濃度為10g/L，Na2CO3（濃度為10mol/L）添加量為2mL，預測值為19.6134g/L。經過擬合試驗的驗證，琥珀酸產量實際值為18.32g/L。驗證值與響應面模型優化值基本一致。并獲得了較高的琥珀酸產量，提高了產琥珀酸放線桿菌的發酵產量，說明優化模型可靠性較好。

2.3 1L厭氧瓶分批發酵放大試驗

經過發酵條件的優化，采用最優的發酵條件，以水解糖質量濃度為59.66g/L（葡萄糖質量濃度為28.84g/L、木糖質量濃度為30.82g/L）的玉米秸稈水解液為原料在1L厭氧甁中進行分批發酵放大試驗，結果如圖8所示。

圖8 1L厭氧瓶中琥珀酸產量和副產物乙酸變化趨勢Fig.8 Variation tendency of succinate and byproducts acetic acid production in anaerobic bottle of 1 L

由圖8可知，在產琥珀酸放線桿菌發酵6h后琥珀酸產量開始大量產生，24h琥珀酸生成速率達到最大，42h琥珀酸的產量達到最高值19.66g/L，此時，琥珀酸生成速率為0.47g/（L·h）。此外，在產琥珀酸放線桿菌發酵產琥珀酸過程中還會伴有少量的副產物乙酸的生成。

3 結論

利用玉米秸稈為原料，通過以水解糖質量濃度為39.99g/L（葡萄糖質量濃度為19.07g/L、木糖質量濃度為20.82g/L）的玉米秸稈水解液為基礎，對溫度培養基和初始pH等因素并結合響應面進行了厭氧甁條件下影響因素的優化研究，得出產琥珀酸放線桿菌（A.succinogenes）ATCC 55618發酵產琥珀酸的最佳培養條件：溫度37℃、初始pH 6.8、水解糖質量濃度70g/L、玉米漿質量濃度10g/L、Na2CO3（10mol/L）2mL。并在1L的厭氧甁中進行了分批發酵放大試驗，琥珀酸產量最高達19.66g/L。可以為進一步利用纖維水解液為原料來擴大規模發酵琥珀酸提供一定的參考。

本研究的主要優勢在于采用可持續利用的秸稈原料，并采用廉價的工業氮源，這將會有效減少現今琥珀酸發酵對淀粉原料的依賴性，并且降低原料成本[6]。這不僅擺脫了對化石能源的依賴，同時又不會與人爭糧，而且開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，使琥珀酸成為未來最重要的生物基化工產品之一[14-16]。

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Optimization of succinic acid fermentation from corn stalk hydrolysate

XIE Hui1,ZHANG Zhaokun1,WU Qiong1,WANG Fengqin1,REN Tianbao2,SONG Andong1*
(1.College of Life Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China; 2.College of Tobacco Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

Using corn stalk hydrolysate as raw material,the fermentation conditions ofActinobacillus succinogenesATCC 55618 were optimized.The effect of culture temperature,initial pH,and medium composition on the production of succinic acid was studied,and the addition of hydrolysised sugar,corn syrup and Na2CO3was optimized by response surface methodology.Results showed that the optimal fermentation was determined as follows:temperature 37℃,initial pH 6.8,hydrolysised sugar mass concentration 60 g/L,corn syrup mass concentration 10 g/L,and 10 mol/L Na2CO32 ml.Scale-up experiments were performed in 1 L anaerobic bottle,and the yield of succinic acid could reach 19.66 g/L.

corn stalk;hydrolysate;succinic acid;optimization;response surface methodology

TQ424.19

A

0254-5071（2014）04-0110-06

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.027

2014-02-23

“十二五”863計劃生物和醫藥技術領域國家科技計劃課題（2012AA022301）

謝慧（1979-），女，講師，博士研究生，研究方向為生物基產品的開發與應用。*

宋安東（1972-），男，教授，博士，研究方向為微生物能源工程。