分光光度法測定釀酒酵母細胞懸液濃度研究

曹國珍，繆建順，張苗苗，王菊芳，李文建，陸棟*

（1.中國科學院近代物理研究所，甘肅蘭州730000；2.蘭州大學藥學院，甘肅蘭州730000；3.甘肅省微生物資源開發利用重點實驗室，甘肅蘭州730000）

分光光度法測定釀酒酵母細胞懸液濃度研究

曹國珍1，2，3，繆建順1，3，張苗苗1，3，王菊芳1，3，李文建1，3，陸棟1，3*

（1.中國科學院近代物理研究所，甘肅蘭州730000；2.蘭州大學藥學院，甘肅蘭州730000；3.甘肅省微生物資源開發利用重點實驗室，甘肅蘭州730000）

采用分光光度法測定釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在不同生長條件、不同時間菌懸液OD600nm值，建立OD600nm在不同稀釋區間的分段回歸方程，利用OD600nm回歸值繪制生長曲線，對比平板菌落計數法測得的生長曲線，研究在對數期與穩定期，OD600nm值與菌體數量以及稀釋倍數的關系。結果表明，稀釋前后OD600nm值在對應區間內呈線性關系，用OD600nm回歸值繪制的生長曲線沒有明顯的衰亡期，其主要是由于在對數期以后OD600nm值與菌體數量不呈線性關系，而在穩定期以前兩者線性良好；得到了OD600nm值在0.2～0.8范圍內與細胞數量的對應關系，還發現實際OD600nm值與稀釋倍數之間并不是簡單的乘積關系，而呈冪函數關系。

分光光度法；OD600nm值；生長曲線；釀酒酵母

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是人類第一個應用的微生物，其發酵性能早已被規模化利用。作為最重要的工業微生物與科學研究的模式生物，釀酒酵母在食品、醫藥、能源化工和環境治理等領域有重要經濟應用價值；同時也是模式生物基因組計劃（model organism genome project，MOGP）的成員，1996年釀酒酵母S288c基因組測序已全部完成[1]。目前，在釀酒酵母的開發與利用方面取得了顯著成果[2]，特別是隨著各種新型育種技術的出現，使獲得滿足于多重發酵需求的菌株成為可能，如陸棟等[3]利用重離子輻照育種方式得到的C03A菌株，使發酵時間縮短12h，乙醇產率提高了13%，就要求對其生長過程中菌體數量變化、生物量累積以及生長規律等要有更加清楚的了解，以便指導工業發酵和基礎研究。生長曲線反映了培養過程中生長和繁殖的規律，同一種釀酒酵母在不同的生長條件下生長曲線也不盡相同，通過生長曲線了解菌體生長繁殖情況，對于根據不同的需要有效地利用和控制釀酒酵母生長具有重要的意義。測定菌體數量的方法主要有直接血球計數板計數法和間接平板菌落計數法，這些方法都比較繁瑣、耗時，所以在實際應用中衡量菌體生長情況多采用簡單、快速的分光光度法，在此方法中常用光密度（optical density，OD）來表示菌懸液濃度。除此之外可以利用OD值來評價菌體的生長情況和生物性能，從而進行相關基礎研究，苑偉等[4]利用菌懸液OD值來衡量釀酒酵母對乙醇的耐受性，ANDREW W等[5]利用OD值作為度量值來研究高產菌株基因與環境的相互作用。但是對于菌體濃度和OD值之間的確切關系，特別是當菌液濃度較大時，用稀釋后的OD值反映菌體濃度等的研究較少。本研究采用分光光度法測定了釀酒酵母在不同生長條件下的生長曲線，并和平板菌落計數法進行比較，然后對稀釋后OD值的回歸方式、不同生長期OD值與菌體細胞個數的相關性以及稀釋倍數和OD值的關系等進行詳細探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：本實驗室保存。酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，瓊脂20g/L，pH值為5.0。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外可見分光光度計：日本島津公司；PHS-3D型pH計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

取活化后斜面釀酒酵母1環，接種于25mL液體YPD培養基中，30℃、200r/min培養14h，備用。

1.3.2 生長曲線的測定

取活化的菌懸液，按1%的接種量分別接種于50mL三角瓶裝25mL培養基（25mL/50mL）、250mL三角瓶裝50mL培養基（50mL/250mL）的2種新鮮YPD培養基中，同時在30℃、200r/min的條件下振蕩培養，分別于0、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h取樣在波長600nm處測定光密度值（OD600nm），濃度過大時應稀釋相應的倍數使OD600nm值在0.1～0.8之間[6-7]；并分別留樣連續稀釋至10-7倍后涂平板，利用平板菌落計數法測定細胞個數，然后分別繪制2種不同測量方法下的生長曲線。

1.3.3 釀酒酵母不同生長時間菌懸液OD600nm值回歸方程的建立

對于較濃的菌懸液在適當稀釋下測OD600nm值后，還需測定此稀釋倍數區間內的任意兩組OD600nm值在上一稀釋倍數區間被稀釋到此稀釋倍數時的OD600nm值，設稀釋前后OD600nm值的關系符合回歸方程：y=ax+b，然后得到OD600nm值的分段回歸方程，計算得到OD600nm值的實際回歸值[8-9]。

1.3.4 OD600nm值與稀釋倍數曲線的繪制

分別取對數期、穩定期的菌懸液，稀釋適當的倍數使其OD600nm盡可能均勻分布在0.1～0.8之間，記錄稀釋倍數與具體的OD600nm值，然后分別以OD600nm值為縱坐標和稀釋倍數為橫坐標繪制關系曲線。

1.4 數據處理

每一組實驗均在相同的情況下重復3次，所有實驗數據均以χˉ±s的形式表示，所用圖形均采用Origin 8.0軟件制作。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母生長曲線測定

2.1.1 分光光度法測定釀酒酵母不同生長條件下的生長曲線

釀酒酵母在不同的裝液量生長條件下連續培養32h，利用分光光度法在600nm波長下測定不同時間點菌懸液光密度，用OD600nm值表示，較濃的菌液稀釋適當倍數后再測定，然后用平板菌落計數法測定對應時間點菌液的細胞個數，結果如表1所示。

表1 釀酒酵母不同生長條件、不同生長時間菌懸液OD600nm值及細胞數量Table 1 OD600nmand cells number ofS.cerevisiaewith different growth time and condition

利用OD600nm值來衡量細胞濃度時必須把OD600nm值回歸到統一的標準上才可以比較。研究發現在不同的稀釋區間，OD600nm值稀釋前后與細胞濃度呈線性關系，本實驗做了3個不同倍數的稀釋，分別為10、20、30倍，需要建立3組對應區間的回歸方程。實驗中分別測定了4h、5h、6h、8h、10h、11h、14h、21h相應稀釋倍數OD600nm值，然后在對應的稀釋范圍內對稀釋前后OD600nm值進行分段線性回歸，結果如表2所示。由表2可知，在一定的稀釋范圍內，稀釋前后OD600nm值（y）與細胞濃度（x）呈明顯的線性關系，分段回歸方程可以用于OD600nm回歸值的計算。

表2 釀酒酵母菌懸液不同稀釋區間OD600nm值分段回歸方程Table 2 Piecewise regression equations of OD600nminS.cerevisiae suspension with different dilution ratio

將不同稀釋倍數下測得的OD600nm值代入對應的回歸方程，得到同一稀釋倍數水平相應的OD600nm回歸值，然后繪制生長曲線，結果見圖1。由圖1可知，在相同時間下50mL/250mL比25mL/50mLOD600nm回歸值略大，這可能是在50mL/250mL條件下相對供氧更足，有利于其生長。但兩者生長曲線的趨勢基本一致，均經過3h左右的延滯期，然后進入對數期，對數期大概為4～12h，然后進入穩定期，此后OD600nm回歸值一直保持在一定的范圍內，看不到明顯的衰亡期，結果與釀酒酵母實際生長不符[10]。為此本實驗又利用平板菌落計數法進行繪制其生長曲線，比較二者的區別。

圖1 分光光度法測得釀酒酵母不同生長條件下的生長曲線Fig.1 Growth curve ofS.cerevisiaewith different growth condition by spectrophotometry

2.1.2 平板菌落計數法繪制釀酒酵母的生長曲線

圖2 平板菌落計數測得釀酒酵母不同生長條件下的生長曲線Fig.2 Growth curve ofS.cerevisiaewith different growth condition by plate count

為了和圖1結果進行比較，采用平板菌落計數法繪制釀酒酵母在25mL/50mL和50mL/250mL下的生長曲線，結果見圖2。與圖1相比圖2中不同生長條件下菌懸液細胞濃度的差異基本一致，圖2中出現了明顯的4個階段：延滯期、對數期、穩定期和衰亡期。其中延滯期、對數期、穩定期與圖1一致，但有明顯的衰亡期。這可能是因為在穩定期的后半段，菌體中衰亡的細胞逐漸增多，分光光度法測定時由于死亡的菌體也會產生一定的吸光度，所以在圖1中沒有明顯的衰亡期。結果表明，OD600nm值在反映菌體濃度時菌體實際的細胞數量之間有一定的差異。

2.2 不同生長期菌體細胞數量與OD600nm值的關系

為了解釋OD600nm值與菌體細胞數量之間的差異，選取了對數期和穩定后期的菌懸液來研究釀酒酵母在不同生長時期OD600nm值與平板菌落計數所得細胞數量的關系，結果見圖3及圖4。

圖3 對數期OD600nm值與菌體細胞數量的關系Fig.3 Relation between OD600nmand cell number in log phase

圖4 穩定期OD600nm值與菌體細胞數量的關系Fig.4 Relation between OD600nmand cell number in stationary phase

由圖3、4可知，在對數期OD600nm值與菌體細胞數量之間有著較好的線性關系，OD600nm為0.618時，細胞數量為2.33×107個/mL，相應的OD600nm回歸值增加到2.054時細胞數量為1.83×108個/mL。這也與圖1、圖2結果相符，說明在對數期細胞生長旺盛，死亡細胞很少，可以用OD600nm值較為準確地反映菌液的細胞濃度。然而在穩定期，特別是穩定期的后半段細胞死亡率大于增長率，實質進入了衰亡期，如圖4所示，細胞數量隨著時間呈現出先增后減的趨勢，OD600nm值與細胞數量之間沒有線性關系，所以在這種情況下不能用OD600nm值來反映菌體的細胞濃度。這也很好的解釋了用OD600nm值作生長曲線時沒有明顯衰亡期的原因，也顯示了利用OD600nm值來衡量菌體濃度的缺陷。

2.3 對數期可信范圍內OD值與細胞數量的對應關系

在科學研究中，很多情況下對菌體細胞個數有明確要求，但是直接測定細胞個數往往很繁瑣，所以利用OD600nm值與菌體細胞個數在穩定期以前的線性關系，可以作出OD600nm值與細胞數量的對應關系，以便及時、準確地了解細胞個數，本實驗所得OD600nm值與細胞數量的對應關系見圖5。

圖5 可信范圍內OD600nm值與菌體細胞數量之間的線性關系Fig.5 Linear relation between OD600nmand cell number

由圖5可知，OD600nm值在0.2～0.8的可信范圍內時，OD600nm值與細胞數量之間線性關系良好。

2.4 OD600nm值與稀釋倍數的關系

有研究發現[11]，在較低的稀釋倍數下，OD值和稀釋倍數是乘冪關系，但對于稀釋倍數較大時是否也是乘冪關系以及初濃度對其的影響等沒有深入研究。本實驗分別選取對數期和穩定期的菌懸液來研究OD600nm值與稀釋倍數的具體關系，繪制OD600nm值與稀釋倍數的關系曲線，結果分別見圖6及圖7。

圖6 對數期OD600nm值與稀釋倍數的關系Fig.6 Relation between OD600nmand dilution ratio in log phase

圖7 穩定期OD600nm值與稀釋倍數的關系Fig.7 Relation between OD600nmand dilution ratio in stationary phases

由圖6及圖7可知，無論是對數期還是穩定期，OD600nm值與稀釋倍數都呈明顯的冪函數關系，擬合度良好，其擬合方程式由最初的菌液濃度決定。說明菌液的細胞濃度隨稀釋倍數并不是均勻下降的，這就更正了先前認為的二者是簡單倍數關系的認識。

3 結論

本研究對稀釋后的OD值進行分段線性回歸，利用回歸方程將OD值回歸到統一標準上，然后繪制生長曲線，將此與平板菌落計數法繪制的生長曲線進行比較，得出以下結論：2種方法測定生長曲線時在穩定期以前基本一致，在穩定期以后出現明顯的差異，前者觀察不到衰亡期。后續OD值與菌體細胞數量關系的實驗發現，在對數期OD值與菌體細胞數量呈良好的線性關系，穩定期以后不再呈線性，這也就解釋了上述生長曲線的差異。這主要是由于進入穩定期后半段以后細胞死亡率開始大于繁殖率，死亡的細胞逐漸增多，再加上菌體自溶[12-13]都會產生一定吸光值，此時的OD值已經不能反映菌懸液的細胞濃度，所以OD值測得的生長曲線在穩定期以后是不可靠的。但在實際工業生產中，更多關注的是菌體進入對數期的時間或者穩定期以前的情況，所以OD值測生長曲線還是有著重要的應用價值。本研究還利用了OD值與菌體細胞數量在穩定期以前的線性關系，進行了不同OD值與細胞數量的對應關系，此結論對釀酒酵母生產和基礎研究中有關菌體數量的測定有著指導性的意義。本實驗結果表明，菌懸液OD值與稀釋倍數之間并不是線性關系，而呈冪函數關系。

在傳統工業生產中，用OD值衡量釀酒酵母的生長過程主要是為了判斷是否進入對數期來指導發酵接種。但近年來研究發現，釀酒酵母在不同的生理時期核糖體以及脅迫相關蛋白都不盡相同[14]，這些差異都會反過來影響到其發酵性能[15]，故利用OD值監測釀酒酵母的生長過程，準確定位生理時期對于發酵生產尤為重要。本研究對于利用OD值來評價菌體生長過程的相關結論對于工業生產和生物學研究有著重要一定的參考價值。

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Determination ofSaccharomyces cerevisiaecell suspension concentration by spectrophotometry

CAO Guozhen1,2,3,MIU Jianshun1,3,ZHANG Miaomiao1,3,WANG Jufang1,3,LI Wenjian1,3,LU Dong1,3*
(1.Institute of Modern Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China; 2.School of pharmacy,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China; 3.Key Laboratory of Microbial Resources Exploition and Application,Lanzhou 730000,China)

The OD600nmvalues ofSaccharomyces cerevisiaewere measured by spectrophotometry under different growth time and condition.The piecewise regression equations of OD600nmvalues with different dilution ratio were established for obtaining growth curves.Comparing to the growth curve which acquired by the plate culture count method,the relation between OD600nmand cell number in log phase and stable phase were studied.Results showed that the OD600nmvalues were linear relation in corresponding interval before and after dilution.The growth curve had no obvious decline phase,mainly due to the relation between OD600nmvalues and yeast cells number didn't show linear relation after log phase,but in linear relation before stable phase.The corresponding relation between OD600nmvalues in 0.2-0.8 range and cell number was gained and the relation on OD600nmvalues and dilution ratio was power function relationship rather than multiplication relation.

spectrophotometry;OD600nmvalue;growth curve;Saccharomyces cerevisiae

Q939.97

A

0254-5071（2014）04-0129-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.031

2014-03-05

中國科學院西部之光人才培養計劃項目（Y306010XB0）；甘肅省自然科學基金項目（1308RJZA316）

曹國珍（1989-），男，碩士研究生，研究方向為輻射生物學。

*通訊作者：陸棟（1979-），男，副研究員，博士，研究方向為生物物理學。