阿爾茨海默病的體液生物標記物研究進展

別立展，倪秀石

(上海交通大學附屬第一人民醫院，上海 200080)

阿爾茨海默病的體液生物標記物研究進展

別立展，倪秀石

(上海交通大學附屬第一人民醫院，上海 200080)

阿爾茨海默??；體液生物標記物；β-淀粉樣蛋白；tau蛋白

阿爾茨海默病(AD)由德國精神病和神經病理學家Alois Alzheimer于1906年最早提出，是一種受年齡和遺傳等多種因素影響的慢性神經退行性疾病。在各種易患因素中，年齡是AD最重要的影響因素，在65歲以上人群中，AD的發生率約為5%，而95歲以上人群中則高達40%～50%[1]。AD以漸進性遺忘及相繼其他認知功能障礙、行為異常、神經心理改變為特征；發病隱匿，呈進行性不可逆性進展。病理學上以神經炎性斑(NPs)又稱老年斑(SPs)、神經原纖維纏結(NFTs)和腦血管淀粉樣變性(CAA)為典型病理特征[2]。腦組織內淀粉樣蛋白質片段異常增加或聚集是導致神經元死亡的主要原因。由于起病隱匿，早期診斷一直是困擾AD的瓶頸。隨著對輕度認知功能損害(MCI)和生物標記物的研究深入，2011年美國國家衰老研究所(NIA)和阿爾茨海默病學會(AA)發布了新的AD診斷標準，NIA-AA診斷標準提出了全新的理念，將AD視為一個連續的疾病過程，分為AD所致癡呆(dementia due to AD)、AD所致輕度認知損害(MCI due to AD)以及臨床前AD(preclinical AD)。新的AD診斷標準引入了生物標記物，為AD的臨床診斷提供輔助依據。AD生物標記物包括體液(腦脊液和血液)生物標記物、風險基因標記物和腦成像標記物等。本文就AD體液生物標記物的研究進展綜述如下。

1 腦脊液生物標記物

1.1 β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ) Aβ是β-淀粉樣前體蛋白(APP)的一個肽段，含有39～42個氨基酸的多肽，因在三維結構中呈β折疊，故稱“β-淀粉樣蛋白”。Aβ具有較強的自聚性，容易形成極難溶解的沉淀，為老年斑的主要成分，是AD的神經病理學標志。Aβ由APP通過蛋白酶裂解而形成，APP位于第21號染色體上，含有19個外顯子，廣泛存在于全身組織細胞上，在腦組織表達最高。APP有2個水解途徑，產生不同的代謝產物：①APP在β和γ分泌酶的共同作用下生成β-淀粉樣多肽Aβ40和Aβ42。研究表明，Aβ42是一種不溶性多肽，更易形成斑塊樣的沉積，是老年斑的核心蛋白，而Aβ40則更易形成典型的纖維，起到延長老年斑的作用，Aβ42必須在Aβ40聚集的情況下才能聚集[3]；②APP由α-分泌酶在Aβ序列16～17位氨基酸之間水解，產生可溶性αAPPs和C83片段多肽。C83再經γ分泌酶作用產生較小的片段P3和另一胞內APP的C端(AICD)片段。目前已知αAPPs具有神經營養和神經保護作用，與學習、記憶功能有關[4]。Aβ具有多重毒性機制：Aβ可以誘導腦神經元產生氧自由基，使神經細胞的膜結構破壞而功能受損；Aβ可以改變神經遞質和信號分子的分布，使細胞內游離鈣離子增多；Aβ可通過多種途徑引發線粒體功能紊亂、軸漿運輸功能障礙、神經元丟失[5-7]。雖然有觀點認為Aβ不是AD發病的始動因素，而是其他病理過程的次發事件，是神經細胞損傷的結果，但目前絕大多數的研究認為Aβ濃度的變化是啟動AD發病的級聯反應，并最終導致AD發病的主要因素。H?glund等[8]對MCI患者腦脊液中Aβ水平進行為期4～6 a的隨訪研究，結果發現，腦脊液中Aβ水平預測MCI發展為AD的敏感性為91%，特異性為64%，隨著隨訪時間的延長，特異性增加到94%。Thaweepoksomboon等[9]檢測比較14例AD患者和16例非AD癡呆患者的腦脊液Aβ1-42濃度，發現有12例AD患者、8例非AD癡呆患者的腦脊液Aβ1-42濃度小于截斷值487 ng/L，其診斷AD的敏感性為85.71%，特異性為50%。Buchhave等[10]對137例MCI患者進行10 a的隨訪，其中72例最終進展為AD。5 a內進展為AD的早期轉化患者和5～10 a內進展為AD的晚期轉換患者的腦脊液Aβ42平均濃度分別為333 ng/L和359 ng/L，取截斷值為<505 ng/L時，預測AD轉化為MCI的敏感性為90%，特異性為76%，約登指數(Youden Index)為0.66，陽性預測率為81%，陰性預測率為87%，證實MCI患者腦脊液的Aβ42濃度可以提前10 a預測是否轉化為AD。Bateman等[11]對128組家族性AD(FAD)患者的腦脊液中Aβ的水平隨訪研究發現，Aβ水平的下降比臨床表現早25 a，比PET成像技術發現腦內Aβ沉淀物早10 a。

1.2 總tau蛋白與磷酸化tau蛋白 細胞內的NFTs主要由雙螺旋纖維聚集而成，病理的雙螺旋纖維主要是由過度磷酸化的tau蛋白組成。tau蛋白基因位于17號染色體長臂。正常人群中由于tau蛋白mRNA剪輯方式不同，可表達出6種同分異構體。tau蛋白為含磷酸基蛋白，正常成人腦中tau蛋白分子含2～3個磷酸基。tau蛋白從結構上可以被分成兩大結構域：突出區和微管結合區，突出區包括分子N端2/3的部分，而微管結合區域包括分子C端的1/3的部分。在各個區域中，有一些特定的結構域主導了tau蛋白的特征和功能。tau蛋白的主要生理功能是促進微管自聚集和穩定微管，這點對于神經元胞內物質的傳輸至關重要。此外，tau蛋白與其他結構和功能蛋白的結合也表明了tau蛋白可能不僅在正常的骨架結構上，而且在神經元的信號轉導上都扮演了重要的角色。tau蛋白通過磷酸化也同樣可參與細胞發育的調節。tau蛋白主要分布于中樞和周圍神經系統的神經細胞軸突中。在正常發育過程中，tau蛋白經歷各種翻譯后修飾，包括磷酸化、糖基化、泛素化、硝基化等，tau蛋白翻譯后修飾已經被廣泛研究，研究人員在大量的神經退行性疾病中發現了翻譯后修飾程度加深的tau蛋白。在眾多的翻譯后修飾中，磷酸化被研究的最為廣泛。在AD患者腦中，磷酸化水平是正常tau蛋白的3～4倍。tau蛋白過度磷酸化是蛋白激酶和蛋白磷酸化酶調節失衡的結果，腦脊液中p-tau的濃度能反映出腦內tau蛋白的磷酸化狀態。到目前為止，AD中大概發現了30個tau蛋白的磷酸化表位，有研究證實[12]，p-tau可在MCI患者中鑒定出潛在的AD患者。對于非特異性腦損傷如急性腦卒中， p-tau含量不會如t-tau般升高，這更說明p-tau對NTFs形成的特異性，作為AD和其他疾病的鑒別診斷，p-tau有更高的敏感性和特異性。研究最為廣泛的是p-tau181和p-tau231，腦脊液中p-tau181含量的升高則反映病情由MCI 向AD惡化，且認知能力迅速下降；腦脊液中p-tau231的含量不僅與大腦新皮質的NTFs相關，還與海馬的萎縮密切相關[13]。Thaweepoksomboon等[9]對30例癡呆患者的研究提示，AD患者與非AD癡呆患者相比，腦脊液中t-tau(≥425 ng/L)和p-tau-181(≥61 ng/L)濃度升高的敏感性僅為7.14%和0%，而特異性高達100%和93.75%。有研究提示，t-tau變化僅能反映軸突損傷的程度，而p-tau在海綿狀腦病或額顳癡呆等非AD神經系統變性性疾病中未見升高，可能更適合于AD的早期診斷[14]。

1.3 Aβ1-42與p-tau蛋白聯合 Aβ1-42與p-tau蛋白的聯合檢測對AD早期診斷有很高的敏感性、特異性和預測價值，特別值得一提的是p-tau181/Aβ42組合，被認為是目前最好的腦脊液生物標記物的診斷組合[15]。Tapiola等[16]對123例患者(79例AD、29例其他類型的癡呆、15例其他神經系統疾病腦脊液中Aβ42和p-tau的濃度)進行13 a的連續隨訪檢測，Aβ42的最佳截斷值為小于515 ng/L，p-tau的最佳截斷值為大于52.5 ng/L，p-tau/ Aβ42比率的最佳截斷值為大于0.0867，其聯合診斷的敏感性為91.6%，特異性為85.7%，與通過病理途徑發現AD患者腦內神經炎性斑的吻合度達到了90.2%，結果令人振奮。同樣，Thaweepoksomboon等[9]通過ELISA法對30例癡呆患者(14例AD患者和16例非AD患者：5例血管性癡呆，5例正常壓力腦積水，4例額顳葉變性和2例其他類型癡呆)的Aβ1-42和p-tau的檢測結果提示：Aβ1-42與p-tau聯合診斷AD的敏感性為92.9%，特異性為100%，與Aβ1-42或p-tau單項相比，診斷AD的敏感性和特異性均有提高。Buchhave等[10]的研究則提示Aβ42/p-tau的比率(截斷值為<6.16)對AD早期診斷的敏感性為88%，特異性為90%；如果進一步結合t-tau的升高(截斷值>350 ng/L)，則診斷的準確率會進一步提升，但有相當一部分臨床前AD的t-tau是不升高的，從而限制了其應用。隨著研究的深入和檢測水平的提升，2個或更多的生物標記物組合應用于AD的臨床診斷，其可靠性和實用性將會進一步提高。

1.4 淀粉樣前體蛋白β-位裂解酶1(BACE1) BACE1是1999年被發現的新型跨膜天冬氨酸蛋白酶，是Aβ產生過程中起決定作用的限速酶。BACE1在多種組織中有表達，但只在腦和胰腺中有高表達。在神經元中的BACE1活性較高。BACE1的一級結構含有501個氨基酸殘基，從N-端到C-端分別是一段含21個氨基酸殘基的信號肽、跨度從22～45號殘基的前蛋白結構域、從46-460號殘基的成熟蛋白腔內結構域、含17個殘基的跨膜結構域和含24個殘基的胞內部分。BACE1的催化區含有2個高度保守的活性位點，分別是DTG(93-95)和DSG(289-291)，突變其中任意一個活性位點都會導致蛋白酶失去活性。BACE1降解通過2條途徑進行：一條是泛素-蛋白酶體化途徑，使用蛋白酶體抑制劑可以減少BACE1的降解，增加下游產物C99和Aβ的表達[17]；另一條即自噬體-溶酶體途徑。APP具有促進和維護神經元生長的生理作用，先后被β分泌酶和γ分泌酶水解后產生不溶性Aβ肽段，其β分泌酶的主要酶活力來自BACE1，而腦脊液BACE1的活性能較好地反映其腦內的活性。研究發現，BACE1的濃度和活性在AD和MCI患者中均升高[18]，在AD患者腦中，有Aβ沉積的前皮質BACE1表達量是無Aβ沉積的小腦的3倍[19]。Jeppsson等[20]發現，在小鼠、豚鼠和非人類的靈長類動物使用BACE1抑制劑(AZD3839)可以有效減緩腦脊液中Aβ水平的下降，抑制腦內Aβ的沉積，目前該藥已進入I期臨床試驗，隨著試驗的進展，期待有更多的研究成果。

1.5 人類軟骨糖蛋白-39(YKL-40) 其屬于哺乳動物18-糖基水解酶家族的成員, 因其一條肽鏈氨基端的起始氨基酸為酪氨酸、賴氨酸和亮氨酸, 相對分子質量約為40 000而被稱為YKL-40，可以被活化的巨噬細胞、血管平滑肌細胞、活化的星形膠質細胞及腫瘤細胞表達。YKL-40在動脈粥樣硬化的發生發展過程中發揮著重要作用，在動脈粥樣硬化、冠心病及心肌梗死等血管性疾病中表達水平升高，并與病情程度及預后有相關性[21]。異常的星形膠質細胞是與淀粉樣蛋白斑塊相關的一小部分，類似于腦脊液tau蛋白，在AD的早期階段(非常輕微的癡呆/ MCI)腦脊液YKL-40的增高就已經非常明顯[22-23]。因此，作為生物標志物的YKL-40可以監測AD病理學的非常早期階段的變化。另外有研究顯示，腦脊液中YKL-40表達水平與Aβ42/p-tau181比率聯合可以提高AD患者診斷的準確率[23]。

1.6 其他新的生物學標記物 與正常老年人相比，AD患者的聽覺皮質、嗅覺皮質和海馬區域的突觸體相關蛋白25(SNAP25)明顯下降[24]；AD患者腦脊液中細胞因子(如IL-1b、IL-2、IL-10、IL-12p70、GM-CSF、IFN-g、TNFα)明顯升高，但相關機制仍不清楚[25]。還有一些生物標記物如心型脂肪酸結合蛋白(heart-FABP)[26]和胰多肽等[27]目前研究資料較少，隨著研究的深入，相信有更多的對AD診斷有特異性的腦脊液的生物標記物會被發現。

2 血液生物標記物

腦脊液樣本采集的嚴格適應證、禁忌證及采集技術都限制了其被廣泛應用。相對于腦脊液樣本，血液樣本的采集更加簡易、方便。但由于血腦屏障的存在，血液中生物標志物的特異性和敏感性必然下降。血液中的生物標記物包括血漿生物標記物和血細胞生物標記物。

2.1 血漿生物標記物

2.1.1 Aβ 既往研究顯示，腦脊液和血漿中的Aβ通過受體介導的雙向運輸而達到動態平衡，血漿中Aβ含量在一定程度上反映了Aβ的代謝程度[28]。在FAD患者中，血漿Aβ水平在發病以前表現為升高，但隨著病情的進展而逐漸下降。Toledo等[29]對715例受試者(348例MCI患者，162例AD患者，205例正常人)進行為期3 a的研究，認為MCI或AD患者的外周血Aβ40、Aβ42濃度較正常參照組會有一些變化，對MCI或AD的早期發現可能有一定的預測能力，但診斷價值有限。Yaffe等[30]對997社區老人進行為期9 a的隨訪研究，同時檢測血液中Aβ40、Aβ42的濃度和Aβ42/Aβ40比率，證實Aβ40含量升高、Aβ42含量降低及Aβ42/Aβ40比率降低與認知功能衰退、直至進展為癡呆的風險之間是有關聯的，在校正了年齡、種族、學歷、吸煙等多種因素后，這種關聯仍然具有統計學上的顯著意義；并且血漿Aβ42濃度與認知功能衰退之間也存在顯著的相關性，但血漿Aβ40濃度與基線認知功能或認知衰退之間未顯示相關性。血漿中Aβ作為AD標記物仍需要更多的研究來確認。

2.1.2 抗Aβ抗體 正常人血漿中存在活性多樣的抗Aβ的IgG、IgM，這些抗體或抗原抗體復合物與Aβ的動態平衡有利于維系APP代謝的穩態[31]。AD患者可能存在清除Aβ的免疫缺陷，從而加速AD的病理生理進程，但迄今為止，研究結果仍沒有明確的結論，而且血漿Aβ抗體的檢測存在諸多影響因素，影響其檢測的靈敏性。

2.1.3 tau蛋白 與腦脊液相比，血漿中tau蛋白含量常常低于可檢測的閾值，目前常規的tau蛋白檢測方法都不能檢出，因此，迄今為止關于外周血液循環中tau蛋白含量的數據仍然很少。至于AD患者腦脊液tau蛋白水平的升高是否可能引起血液中tau蛋白水平的升高，目前尚無定論[29]。

2.1.4 分子伴侶 分子伴侶是一類廣泛存在、高度保守的蛋白質。一個蛋白質從翻譯出來開始一直到它被降解為止，都離不開分子伴侶的陪伴。新生肽鏈的折疊、裝配、運輸、細胞內定位、蛋白質復合體的裝配、受到損傷后的修復以及最終被蛋白酶體或溶酶體降解都需要分子伴侶的參與，同時分子伴侶還參與了多條信號轉導通路的調節、細胞凋亡的調控和免疫反應中抗原的提呈等細胞重要活動。細胞外液中存在大量的Aβ分子伴侶，參與Aβ聚集或清除，與AD發病密切相關[32]。

2.1.4.1 叢生蛋白 作為Aβ胞外的伴侶蛋白，叢生蛋白廣泛存在于體液中，可以與一系列蛋白結合，參于體內多種代謝過程，具有重要的生物學功能。在外周，由肝細胞分泌，肝臟、腎臟等組織高表達。在血漿中，主要與人體內高密度脂蛋白顆粒結合，約30%與血小板結合。在中樞，主要由星形細胞分泌，在腦脊液中，叢生蛋白亦主要與高密度脂蛋白結合。由于在血漿和腦脊液中均與脂質成分結合，發揮載脂蛋白的功能，叢生蛋白也稱載脂蛋白J(ApoJ)。有研究認為[33]叢生蛋白在AD的病理生理進程中具有保護作用，其可能的作用途徑：①與Aβ片段結合，阻止其聚集；②與低密度脂蛋白受體相關蛋白Ⅱ(LRP-2)受體結合，增強小膠質細胞對Aβ片段及Aβ纖維原的吞噬作用；③為一種補體抑制劑，可以抑制AD病理性補體的激活；④同樣存在于脂蛋白微粒，對AD患者中存在的膽固醇及脂質代謝的紊亂具有重要調節作用；⑤應激情況下，大部分叢生蛋白分泌至胞外，小部分叢生蛋白可與胞質內相關信號轉導分子結合，抑制神經元凋亡或增強神經保護因子和轉化生長因子的信號轉導。Thambisetty等[34]研究發現，血漿叢生蛋白水平與AD患者的腦萎縮、疾病嚴重程度以及臨床進展相關，而且觀察到，在臨床進展較快的AD患者，血漿叢生蛋白濃度增高。進一步研究證實，外周血漿中叢生蛋白是AD患者腦內病理變化的生物標志，并且其濃度的升高與AD進展速度及病情嚴重程度相關[35]。Schrijvers等[36]為評估叢生蛋白與AD病情嚴重程度和發病風險的相關性，檢測了60例AD患者的基線叢生蛋白濃度，以及隨機隊列926例受試者和隨訪過程中156例新發AD患者的血漿叢生蛋白濃度，在校正年齡、性別、教育水平、吸煙、糖尿病、冠心病和高血壓等因素后，發現叢生蛋白每增加一個標準差，AD患病風險上升49%、AD患者MMSE評分下降1.36，提示血漿叢生蛋白水平與AD的基線患病率和嚴重程度顯著相關，但與AD發病率關系不明。

2.1.4.2 血清淀粉樣P物質(SAP) SAP參與固有免疫、炎癥反應和淀粉樣病變等重要的生理病理過程。SAP可與所有類型的含淀粉樣的原纖維結合，并且在淀粉樣沉淀中廣泛存在。SAP可與細胞外淀粉樣纖維結合，抵抗蛋白酶的作用，使淀粉樣纖維不被降解。研究發現SAP由激活的小膠質細胞產生與釋放，并具有與Aβ結合、抑制Aβ纖維降解和促進其神經毒性的作用[37]。

2.1.4.3 觸珠蛋白 觸珠蛋白又稱結合珠蛋白，是肝臟合成的一種α2球蛋白，約占血漿總蛋白的1%，能與血漿中游離的氧合血紅蛋白結合形成復合物，為一種抗氧化蛋白，可能與AD的氧化應激相關。研究發現觸珠蛋白在外周血中濃度的改變可能有助監測大腦淀粉樣變化的進展[38]，但對AD的早期診斷未顯示有明顯的敏感性，且檢測難度較大。

2.1.5 細胞周期蛋白 Song等[39]對176例受試者(74例AD患者、11例帕金森病患者、11例血管性癡呆患者、80例認知功能正常對照者)通過ELISA法檢測外周血淋巴細胞中的細胞周期素E(Cyclin E)、周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)、視網膜母細胞瘤腫瘤抑制蛋白(Rb)和轉錄因子E2F1，發現AD患者組的這四種細胞周期蛋白表達增加，與其他3組相比，顯示有較高的敏感性(Cyclin E 81%、Rb 89%、CDK2 78% 、E2F-1 85% )和特異性(Cyclin E 84%、Rb 74%、CDK2 80%、E2F-1 85% )，表明細胞周期蛋白具有作為AD生物標志物的潛力，值得進一步研究。

2.2 血細胞生物標記物

2.2.1 血小板和APP 異構體蛋白在AD的發病過程中起重要作用，其降解產生的Aβ聚合體可以損傷突觸和神經元。在外周細胞中，血小板由于其表達APP異構體的濃度與腦細胞相當而受到廣泛關注。在血小板中，完整的APP將被加工成分子量為130，110，106 kD 3種異構體，高分子量(130 kD)和低分子量(110 kD和106 kD之和)比例稱為APP異構體比值(APPr)，在AD患者中APPr下降且和疾病嚴重程度相關，敏感性和特異性在80%～95%，是評價AD疾病進程和治療效果的理想標記物[40]。Zainaghi等[41]對34例MCI患者和21例AD患者研究隨訪4 a，發現血小板APPr在MCI進展為AD時顯著降低，而且預測的準確性相當好，但其測定方法是基于蛋白印跡技術，并需光密度掃描進行濃度測定，由于技術上的局限性，與血漿中Aβ水平研究相比，仍需進一步大樣本的研究。

2.2.2 外周血單核細胞(PBMC) 研究表明Aβ聚集和沉積可以引起腦內星形膠質細胞和小膠質細胞的異常激活，這些異常激活的細胞可以進一步分泌大量趨化因子(如補體片段C1q、C3b等)，趨化外周血單核細胞從微血管透過血腦屏障參與腦內Aβ寡聚體的吞噬和清除，但PBMC的這種功能在AD患者中存在明顯損害，且這些參與Aβ清除的外周血單核細胞易于凋亡，最終導致血管周圍Aβ的沉積[42]。檢測PBMC對Aβ1-42的吞噬清除功能對AD早期診斷具有潛在的應用價值，值得進一步研究。

總之，隨著人口老齡化不斷加速，AD患者帶來的醫療和社會負擔日益嚴重。生物標記物為AD的機制研究、預防監控、早期診斷、病情評估和療效評價提供了一個很有前途的方法。隨著對AD發病機制的深入研究及相關檢測技術的發展，更多的高靈敏性和特異性的生物標記物將會不斷被發現。從臨床前AD到AD所致癡呆，AD是一個連續的疾病過程。對AD的治療也應該從“以治療為主”逐漸向“防治并重”發展，并期待在不久的將來轉變為“以預防為主”，讓千千萬萬的AD患者能夠擺脫陰影，享受有質量的生命和有尊嚴的人生。

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倪秀石，E-mail：drnixiushi@sina.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2014.34.041

R749.16

A

1008-8849(2014)34-3867-05

2013-10-25