SEDS工藝制備絲素納米顆粒及其表征

鄧愛華，陳愛政，2，王士斌，2，王明宗

（1 華僑大學化工學院，福建 廈門 361021；2 華僑大學生物材料與組織工程研究所，福建 廈門 361021）

絲素蛋白是一種來源于桑蠶絲和柞蠶絲的纖維蛋白，主要由甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等18種氨基酸組成，可分為重鏈（約390kDa）、輕鏈（約26kDa）及糖蛋白鏈（約28kDa）3部分[1]。絲素蛋白具有良好的降解性、生物相容性、力學性能和可塑性[2-3]，已廣泛應用于藥物的緩（控）釋載體材料[4-6]。目前，絲素載藥顆粒的主要制備方法有乳化-溶劑揮發法[7]、相分離法[8]、高壓靜電法[9]和噴霧干燥法[10]等，這些方法由于有機溶劑殘留或使用高溫導致制備的絲素藥物載體存在一定的細胞毒性或藥物失活等問題。超臨界流體技術因能有效地去除殘留的有機溶劑，且操作條件溫和等特點倍受研究者的青睞[11-13]。特別是超臨界流體強制分散溶液（SEDS）工藝引入同軸二流式噴嘴[14]，使溶液充分霧化并強化液滴與超臨界流體的混合傳質，獲得更高的溶液過飽和速率與結晶沉淀速率，從而析出細小的顆粒[15-16]。相比其他超臨界流體技術，該技術制備的納米顆粒粒徑更小[17-19]。本實驗采用SEDS工藝制備了絲素納米顆粒，并對絲素納米顆粒進行了相關性能的表征。

1 實驗材料與儀器設備

1.1 主要試劑

絲素蛋白，平均相對分子質量250000，湖州新天絲生物技術有限公司；CO2，純度 99.9%，廈門日宏實業發展有限公司；六氟異丙醇，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器

FTIR-8400S傅里葉紅外變換光譜儀，日本Shimadzu公司；S-4800場發射掃描電鏡，日本Hitachi公司；Zen-3600動態激光光散射儀，英國Malvern公司；D8Advance X射線衍射儀，德國Bruker-Axs公司；6890N氣相色譜儀，美國Agilent公司；HA220-50-06改進型超臨界造粒裝置，南通華安超臨界萃取有限公司。

2 實驗方法

2.1 絲素納米顆粒的制備

先向結晶釜內通入CO2氣體，待結晶釜內達到一定的壓力時，保持CO2泵入速率不變，開啟放氣閥以恒定速率放氣，并調節結晶釜外部恒溫箱 35℃，保持釜內壓力和溫度恒定，超臨界二氧化碳（SC-CO2）通過結晶釜頂部的同軸噴嘴外側通道，將一定濃度的絲素/六氟異丙醇溶液以一定的流速由高壓恒流泵通過內側的通道，同時泵入結晶釜。結束進樣后，維持釜內壓力及溫度不變，繼續通入新鮮的CO2萃取30min。萃取完成，緩慢卸壓，待釜內壓力降為常壓時，打開結晶釜收集樣品，造粒裝置見圖1。

2.2 電鏡觀察和粒徑分布

取不同條件下制備的絲素納米粒，經真空干燥后，用E-1010型離子噴射儀噴金180s，然后用掃描電子顯微鏡觀察其表面形態。將絲素納米顆粒經乙醇超聲分散后，通過動態激光光散射儀測試粒徑分布情況。

2.3 Zeta電位測試

取適量樣品，放入20m L離心管內，加入15m L乙醇，超聲分散3m in后取出，室溫放置至25℃，用針筒取少量混懸液裝入樣品池內，測試樣品的Zeta電位。

2.4 有機溶劑殘留測試

稱取 500mg絲素納米粒，用頂空-氣相色譜儀檢測絲素納米顆粒中六氟異丙醇的殘余量。測試條件如下。色譜柱為 DB-624毛細管柱；進樣口 210℃；檢測器（FID）溫度250℃。柱溫：程序升溫，初始40℃，保持7m in，以 30℃/min升至180℃，保持3min；載氣為氮氣99.999%；流速1.0m L/min；分流模式為分流比 10∶1。頂空進樣器加熱參數：加熱溫度為85℃，加熱時間為30m in。

2.5 結構表征

圖1 SEDS工藝裝置示意圖

采用KBr壓片法，在波數4000～400cm-1范圍內采用傅里葉紅外光譜儀檢測樣品的特征官能團；取適量樣品在玻璃板上鋪平，以Cu-Kα作為放射源，X射線衍射儀在10°～35°掃描樣品；差示掃描量熱儀測試溫度為30～300℃，升溫速率10℃/min，空氣氣氛，氣體流量20μL/min，載氣為氬氣。

3 結果與討論

3.1 單因素實驗

3.1.1 壓力的影響

在絲素溶液濃度5g/L、溶液流速1.0m L/min、CO2流速500 L/h的條件下，考察結晶釜內不同壓力下納米顆粒的粒徑分布和形貌，結果如表1和圖2所示。

表1 不同壓力條件制備的納米粒平均粒徑

從表1可知，隨著壓力增大，絲素納米顆粒平均粒徑增大；而圖2顯示粒徑尺寸變化不明顯，且出現顆粒的黏結。一方面，隨著壓力增大，釜內CO2密度增大，有機溶劑在SC-CO2中的擴散系數增大，有機溶劑進入SC-CO2中的速度加快[20]，溶劑對溶質的溶解力降低[21]，有利于結晶顆粒成核，從而形成較小的納米顆粒；另一方面，隨著壓力增大，溶劑/非溶劑之間的密度差在降低，傳質推動力降低，使得傳質時間變長，顆粒發生相互黏結，顆粒實際尺寸增大[22]。

3.1.2 溶液濃度的影響

在結晶釜內壓力10MPa、溶液流速1.0m L/min、CO2流速500L/h條件下，考察了不同絲素溶液濃度下納米顆粒的粒徑分布和形貌，結果如表2和圖3所示。

表2 不同濃度條件制備的納米粒平均粒徑

圖2 不同壓力條件制備的絲素納米粒

圖3 不同溶液濃度下制備的絲素納米粒

從表2和圖3可知，隨著絲素溶液濃度的增大，納米顆粒平均粒徑增大。隨著溶液濃度增大，絲素含量高，黏度大，而當其他變量恒定時，液體形成的霧滴較大，使得 SC-CO2與有機溶液接觸面積減少，傳質效果減弱，霧滴達到過飽和狀態的時間加長，瞬間成核數量減少，顆粒的沉積以生長為主要機理，所以形成的顆粒粒徑較大。同時高濃度的絲素溶液可能會降低霧化強度，以致液滴無法被打碎形成更小的液滴，容易發生交聯現象，這與Franceschia等[23]的研究結果一致。

3.1.3 溶液流速的影響

在結晶釜內壓力10MPa、溶液濃度10g/L、CO2流速500L/h的條件下，考察了在不同絲素溶液流速下納米顆粒的粒徑分布和形貌，結果如表3和圖4所示。

從表3和圖4可知，當絲素溶液流速在0.5～1.0m L/min時，絲素納米顆粒粒徑變化不明顯，甚至出現了減小的趨勢；但當溶液流速增加到1.5m L/min時，納米顆粒平均粒徑增大。可能是由于在低溶液流速下，增大溶液流速，動能增加，溶液與 S C-CO2的作用力增加，有機溶劑更快擴散進入SC-CO2，從而導致快速結晶，形成的粒徑較小；而在高溶液流速下，絲素溶液流速增大，SC-CO2和有機溶劑的接觸面積減少，傳質效果減弱，導致過飽和率降低，成核數量減少，顆粒以生長為主要機理，得到的粒徑較大[24-25]。

3.1.4 CO2流速的影響

在結晶釜內壓力10MPa、絲素溶液濃度10g/L、溶液流速1.0m L/min的條件下，考察了不同CO2流速下納米顆粒的粒徑分布和形貌，結果如表4和圖5所示。

表3 不同流速條件制備的納米粒平均粒徑

表4 不同CO2流速條件制備的納米粒平均粒徑

圖4 不同流速條件制備的絲素納米粒

圖5 不同CO2流速條件制備的絲素納米粒

從表4和圖5可知，在1000～1500L/h的范圍內，隨CO2流速的增加，絲素納米顆粒平均粒徑略有減小。這可能是由于隨著 CO2流速的增加，SC-CO2動能增加，溶劑和SC-CO2作用力增大，從而有利于形成較小的顆粒[26-27]。當繼續增加CO2流速到2000L/h時，此時動能的影響不明顯，粒徑變化不明顯（表4）；由于CO2的相對含量增加，反而導致過飽和度降低，成核數量減少，成核時間長，在顆粒形貌上有增大的跡象（圖5）。

3.2 Zeta電位

為考察同一操作條件下，不同粒度的樣品的Zeta電位，按單因素考察 3.1.1中制備不同壓力條件下的樣品，測量其Zeta電位，結果如表5所示。

表5 不同壓力條件制備的納米粒Zeta電位

影響Zeta電位的顯著因素有：分散劑的性質、樣品的濃度和樣品的表面電荷性。從表5可看出絲素納米顆粒表面呈電負性，且 Zeta電位值均比較高，說明絲素納米顆粒較為穩定。此外，在考察的壓力范圍下，粒徑和電位存在對應關系，粒徑隨電位絕對值的增大而減小。

3.3 有機溶劑殘余量

在釜內壓力為10MPa，溶液濃度為10g/L，溶液流速為1.0m L/m in，CO2流速為500L/h條件下制備絲素納米顆粒，經過頂空-氣相色譜法檢測，溶劑出峰時間在5.3m in，殘留量為20μL/L。盡管SEDS工藝使用有機溶劑，但基于 SC-CO2良好的擴散和傳質性能，能夠迅速擴散和穿透進入納米顆粒的內部，從而將納米顆粒內部的有機溶劑萃取出來帶走[28]。如SEDS工藝制備的PLLA/PLGA納米顆粒有機溶劑的殘余量為39μL/L[29]，而高壓靜電噴霧法制備的樣品在凍干幾天后有機溶劑殘留達到365μL/L[30]，噴霧干燥法制備的納米顆粒有機溶劑殘留甚至高達40000μL/L[31]。由此可見SEDS工藝在制備納米顆粒上具有有機溶劑殘留量低的優點，從而有效解決有機溶劑殘留對人體帶來的炎癥反應。

3.4 紅外光譜分析

絲素經SEDS工藝處理前后的紅外光譜分析見圖6。從圖6可知，絲素在1650cm-1吸收峰為氨基Ⅰ（1705～1595cm-1）的特征峰，在1540cm-1吸收峰為氨基Ⅱ（1595～1495cm-1）的特征峰，表明絲素處理前后均存在無規則卷曲結構[32]。此外，絲素經 SEDS工藝處理前后紅外特征吸收峰沒有明顯偏移，說明絲素的化學結構、官能團未發生明顯變化[33]。

圖6 絲素經SEDS處理前后的紅外圖譜

3.5 X射線衍射分析

絲素經SEDS處理前后X射線衍射譜圖見圖7。從圖7可知，絲素原料在20.4°出現一寬衍射峰，說明絲素原料分子結構主要是無規則卷曲和無定形狀態，其中絲素Ⅰ型結構的衍射峰在12.2°，Ⅱ型結構衍射峰在9.6°和20.4°。而經SEDS工藝處理后的絲素納米顆粒在 20.4°衍射峰變窄，12.2°衍射峰降低，說明絲素內部分子結構發生重排，從無規則卷曲向β結構轉換[34]。

3.6 差示掃描量熱分析

絲素經SEDS工藝處理前后差示掃描量熱曲線見圖8。從圖8可知，絲素原料的玻璃化轉變溫度和分解溫度分別為183.1℃和280.8℃；而絲素納米顆粒的玻璃化溫度遷移到183.7℃，說明絲素結晶結構發生了部分改變，從無規則卷曲向β結構轉換[35]。

4 結 論

圖7 絲素經SEDS處理前后的X射線衍射圖

（1）以絲素蛋白為原料，以六氟異丙醇為溶劑，SEDS工藝制備了絲素納米顆粒。經動態激光光散射儀檢測表明：隨壓力、溶液濃度和流速的增大，絲素納米顆粒平均粒徑增大；隨CO2流速的增大，絲素納米顆粒平均粒徑略有減小，最小達到298nm。

圖8 絲素經SEDS處理前后的DSC曲線

（2）絲素納米顆粒Zeta電位為-39mV，有機溶劑殘留量為20μL/L。

（3）絲素材料經SEDS工藝處理后化學結構和官能團不會發生變化，但分子結構發生重排，由無規則卷曲向β折疊轉換。

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