基于果糖與葡萄糖不同混合比例的丙酮丁醇發酵

吳又多，付友思，齊高相，陳麗杰，白鳳武，2

（1 大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024；2 上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240）

能源是推動社會經濟可持續發展的關鍵，隨著傳統石油資源的逐漸枯竭以及原油價格的不斷上漲，探索新型可再生能源已成為當前生物質能源領域的研究熱點[1-3]，丁醇作為新一代可再生生物燃料極具發展潛力[4-6]。傳統丁醇發酵工藝主要以糧食作物玉米或糖蜜作為原料，生產成本超過總成本的60%，較低的經濟適用性及丁醇產量嚴重制約了其工業發展[7-8]，亟待來源更為豐富且更為廉價的非糧生物質原料，并優化發酵條件[9-13]，以期建立經濟型生物丁醇發酵制造工藝[1，7，14-15]。

果聚糖作為自然界中含量較為豐富的碳水化合物資源之一，廣泛存在于菊芋、菊苣、大麗花等植物中。其中，菊芋是近年來廣為利用的一種廉價非糧生物質物料，富含果糖資源且具有較高的生物質產量[16-17]，具有明顯的作物抗逆特性，其塊莖水解液中葡萄糖與果糖成分比例接近1∶4。事實上，果糖基物料用于丁醇發酵的研究報道相對較少，Marchal等[18]利用 Clostridium acetobutylicum IFP904發酵經菊粉酶水解過的菊粉，丙酮和丁醇的總溶劑產量達到 23～24g/L。陳麗杰等[19]利用 C.acetobutylicum L7發酵菊芋水解液，丁醇濃度達到了11.21g/L。這主要是因為在以葡萄糖及果糖混合體系為底物模擬菊芋物料進行的丁醇發酵中，存在著果糖利用率較低及丁醇代謝合成能力不足等關鍵問題[20]。本文對基于果糖與葡萄糖不同混合比例的丁醇發酵性能進行了研究，結果表明二者混合比例能夠影響果糖利用能力，為探究葡萄糖與果糖的代謝利用提供了重要的實驗依據，也為果糖基物料的高效生物轉化生產丁醇提供重要的理論參考及技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

所使用菌株系本實驗室馴化保存的丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌C.acetobutulicum L7。

1.2 方法

1.2.1 培養基

活化培養基[21]（g/L）：葡萄糖 20， 胰蛋白胨30， 酵母粉 10。

種子培養基（g/L）：混合糖（果糖與葡萄糖）55，乙酸銨 2.76，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.01，FeSO4·7H2O 0.01，對氨基苯甲酸0.01，生物素0.01，酵母粉2。

發酵培養基[22]（g/L）：混合糖（果糖與葡萄糖）55，乙酸銨 2.76，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.01，FeSO4·7H2O 0.01，對氨基苯甲酸0.01，生物素0.01，酵母粉2。

葡萄糖及果糖混合比例依次由1∶2、2∶3、3∶2提高至3∶1，上述培養基接種前均在121℃蒸汽滅菌15min。

1.2.2 培養方法

菌種活化培養：活化培養基預先置于厭氧操作箱（Thermo Scientific，Forma Anaerobic System）過夜除氧，將冷凍保藏的菌種溫育后以 5%（體積分數，下同）接種量接種于20m L活化培養基中，自然初始pH值，37.5℃厭氧培養18～20h。

種子擴大培養：種子培養基預先置于厭氧操作箱過夜除氧，將充分活化的菌種以10%）接種量接種于100m L種子培養基中，自然初始pH值，37.5℃厭氧培養18～20h。

發酵培養：預先向發酵罐（1.5BG-4-3000，Shanghai Baoxing Engineering，China）通入無菌高純N2至15min，以保證其厭氧發酵體系，將擴大培養的菌種以10%接種量接種于1.1L發酵培養基中，在37.5℃，150r/min，初始pH值5.5條件下進行發酵。

1.2.3 分析方法

生物量測定，取200μL發酵液，在酶標儀上測定其在 620nm 處吸光度（OD620），菌體濃度= 0.8009×OD620g/L；葡萄糖濃度采用葡萄糖分析儀（Biosensor SBA-50，Institute of Biology，Shandong Academy of Sciences，Shandong，China）進行定量測定，總還原糖濃度測定采用DNS法[23]進行測定，果糖濃度即為總還原糖濃度與葡萄糖濃度之差；發酵液中丙酮、乙醇及丁醇組分濃度采用氣相色譜（Agilent 6890A GC）進行定量測定，色譜分離條件：毛細管色譜柱Agilent HP-INNOWAX （30m×0.25mm×0.50μm），柱溫100℃，進樣口溫度250℃，FID 檢測器溫度300℃，H2流速40m L/min，空氣流速400m L/min，載氣N2流速 30m L/m in，進樣量0.2μL，分流比 50∶1，內標物為異丁醇。發酵液中乙酸和丁酸組分濃度采用高效液相色譜（Waters 1525 HPLC）進行定量測定，色譜分離條件：有機酸分析柱 Aminex HPX-87H （300mm×7.8mm；Bio-Rad，Hercules），流動相0.005 mol/L H2SO4，流速0.5m L/min，進樣量20μL，柱溫50℃，檢測波長 210nm，示差折光檢測器溫度 50℃。色譜柱：Am inex HPX-87H 有機酸分析柱（300 mm×7.8mm，Bio-Rad，Hercules），流動相0.005mol/L H2SO4，流速0.5m L/m in，進樣量20μL，柱溫50℃，檢測波長210nm，二極管矩陣檢測器溫度50℃。

2 結果與討論

2.1 果糖與葡萄糖不同混合比例下的丁醇發酵

前期研究工作分別以55g/L不同底物（葡萄糖、果糖、混合糖及菊芋水解液）進行了批次丁醇發酵，發酵結果如表1所示。以單一葡萄糖為底物的丁醇發酵周期最短，丁醇產量最高達到了11.2g/L，丁醇及總溶劑產率分別為0.255g/(L·h)與0.427g/(L·h)，轉化率分別達到了0.204g/g與0.342g/g，而以單一果糖為底物的丁醇發酵周期長達124h，發酵效率相對較低，丁醇及總溶劑產率分別為 0.083g/(L·h)與0.133g/(L·h)，轉化率分別為0.188g/g與0.300g/g，表明丙酮丁醇梭菌對果糖代謝速率較低，但發酵終點丁醇產量仍可達到10.3g/L。然而在以混合糖（葡萄糖∶果糖=1∶4）模擬菊芋物料為底物的丁醇發酵中，盡管發酵周期縮短至 76h，但終點果糖殘余濃度高達 23.3g/L，丁醇與總溶劑產量僅為 5.5g/L及9.0g/L，糖轉化率及溶劑產率極低，且發酵過程中菌體代謝利用果糖能力不足，嚴重制約了發酵效率，而這一結果同以菊芋水解液為底物的丁醇發酵結果極其相似。因此探究果糖與葡萄糖二者混合比例對丁醇發酵性能的影響，有效降低發酵終點殘糖濃度，提高果糖利用率，為菊芋實際物料的高效利用具有非常重要的科研及現實意義。

2.1.1 葡萄糖與果糖混合比例為1∶2的丁醇發酵

當葡萄糖與果糖混合比例為 1∶2時，如圖1所示，發酵周期為 68h，相對于混合糖模擬菊芋物料發酵過程縮短了8h，發酵終點丁醇及總溶劑產量達到了 9.7g/L與 16.0g/L，分別提高了 76.4%與 77.8%，終點殘糖濃度僅為 2.1g/L，有機酸濃度為5.6g/L且在發酵中后期無明顯重吸收過程。發酵至24h葡萄糖消耗殆盡，而果糖發酵至12h開始進行代謝利用，前期葡萄糖阻遏效應較為明顯，而伴隨著葡萄糖進一步消耗，果糖可被緩慢協同利用。菌體達到最大濃度OD620為2.4，隨后菌體濃度OD620開始出現短暫下降。發酵28～44h果糖代謝與溶劑代謝近乎停滯，而發酵至56h左右，菌體細胞呈現出明顯的二次生長狀態，表明菌體代謝活性得到恢復，此后果糖得到迅速利用，相應的菌體濃度OD620再次回升至2.4，與此同時，丁醇等主要溶劑開始迅速積累。以上實驗結果表明，適當提高葡萄糖/果糖比例能夠保證發酵后期菌體細胞的代謝活性，進而有利于對果糖的代謝利用，有效降低發酵終點果糖濃度，丁醇等溶劑代謝合成得以順利進行。

2.1.2 葡萄糖與果糖混合比例為2∶3的丁醇發酵

圖1 葡萄糖與果糖混合比例為1∶2的丁醇發酵

表1 不同發酵底物條件下的丙酮丁醇發酵結果

當葡萄糖與果糖混合比例提高至2∶3時，發酵至28h時葡萄糖消耗殆盡，而發酵至16h時果糖代謝利用開始緩慢進行，此時菌體濃度最大OD620提高至3.5，發酵周期縮短至52h，丁醇及總溶劑產量有所下降，分別為 8.0g/L與 12.4g/L，此外，發酵終點有機酸濃度較高，見圖2。值得注意的是，發酵至32h左右時進入了短暫的二次生長狀態，但果糖代謝利用活性依然較低，發酵終點果糖濃度高達14.7g/L。以上實驗結果表明，進一步提高葡萄糖/果糖比例至2∶3后，菌體細胞活性雖然有所恢復，但對果糖的代謝利用能力仍顯不足。

圖2 葡萄糖與果糖混合比例為2∶3的丁醇發酵

2.1.3 葡萄糖與果糖混合比例為3∶2的丁醇發酵

當底物糖中葡萄糖比例進一步提高，發酵周期再次縮短至48h，至24h葡萄糖消耗殆盡，而果糖代謝依然從發酵至16h開始，此前同樣出現了明顯的葡萄糖阻遏效應。在此過程中菌體達到最大OD620為4.2，隨后快速下降直至發酵終點，發酵后期過程中并未出現二次生長狀態。最終丁醇及總溶劑產量分別達到 9.0g/L及 15.0g/L，殘糖濃度下降至 7.9g/L，但果糖利用率有所降低，見圖3。此外有機酸濃度降至2.9g/L，而發酵過程中有機酸含量亦有所下降，說明進一步提高葡萄糖/果糖比例至3∶2一定程度上緩解了有機酸積累現象，但對于發酵中后期果糖的代謝利用活性并沒有有效提高。

2.1.4 葡萄糖與果糖混合比例為3∶1的丁醇發酵

圖3 葡萄糖與果糖混合比例為3∶2的丁醇發酵

圖4 葡萄糖與果糖混合比例為3∶1的丁醇發酵

當葡萄糖與果糖混合比例最終提高至3∶1時，試驗結果見圖4。發酵時間為48h，此時葡萄糖基本消耗殆盡，發酵至 28h，菌體濃度達到最大 OD620為4.3，已接近以單一葡萄糖為底物的發酵水平。發酵終點丁醇及總溶劑產量分別達到 9.2g/L及15.5g/L，有機酸濃度降至2.3g/L，果糖殘余濃度為8.6g/L，果糖利用率下降。以上實驗結果表明，當葡萄糖/果糖比例進一步提高至3∶1時，菌體細胞主要以葡萄糖為發酵底物，且發酵后期并未出現利用果糖的二次生長狀態，相反發酵全程果糖代謝利用極其緩慢，葡萄糖阻遏效應明顯，最終導致菌體細胞代謝果糖生產丁醇能力不足。

2.2 葡萄糖與果糖不同混合比例對果糖利用效率及丁醇產量的影響

前期研究發現，菊芋水解液中葡萄糖與果糖組成比例接近1∶4，且在分別以菊芋水解液及葡萄糖/果糖混合糖模擬物料為底物的批次丁醇發酵過程中，存在發酵提前終止，果糖利用率較低，丁醇等溶劑產量較低等技術問題。研究工作隨后改變混合糖模擬體系中葡萄糖與果糖比例探究其對丁醇發酵性能的影響，結果如表2所示，隨著葡萄糖與果糖混合比例的提高，雖然細胞生長、葡萄糖代謝利用及溶劑代謝合成能力明顯增強，但是果糖利用效率并沒有相應隨之不斷提高。其中，當葡萄糖/果糖混合比例為1∶2時，果糖利用率最佳，終點果糖利用效率高達95.0%，這一結果與該條件下發酵過程中出現的二次生長狀態相一致，表明果糖能量代謝相對活躍，這對后續溶劑代謝合成的順利進行至關重要。與此同時，而隨著葡萄糖/果糖混合比例的繼續提高直至3∶1時，發酵性能已接近以葡萄糖為底物的丁醇發酵，盡管丁醇等溶劑合成速率提升，但果糖利用率反而明顯下降，此時發酵過程中溶劑代謝主要來源于底物葡萄糖。這些結果表明，適當提高葡萄糖/果糖混合比例將有利于菌體細胞對果糖的代謝利用。

事實上，依賴于磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸轉移酶系統（PTS）是嚴格厭氧菌和兼性厭氧菌吸收糖類的主要機制，C.acetobutylicum中的磷酸轉移酶系統與Clostridium pasteurianum、 Bacillus subtilis及Escherichia coli中PTS系統相似[24]，糖類在被轉運吸收的同時也要經過磷酸化[25-27]，葡萄糖、果糖等六碳糖必須通過磷酸轉移酶系統的磷酸化進入菌體內[28]。另一方面，Hutkins等[29]在C.acetobutylicum中發現，菌體轉運葡萄糖和果糖的磷酸轉移酶系統不同，它們的區別就在于催化葡萄糖磷酸化的酶為葡萄糖激酶，而催化果糖轉運并磷酸化為果糖-6-P的酶為特異性的果糖激酶[30]。在本研究中，在不同葡萄糖/果糖混合比例下，批次丁醇發酵前期葡萄糖對果糖利用主要表現出一定的阻遏效應，但是在葡萄糖消耗殆盡前仍有較短的協同利用階段。在此前提下，發酵后期果糖代謝利用能力具有明顯差異性，如在葡萄糖/果糖比例為1∶2條件下，菌體細胞出現典型的二次生長狀態，在葡萄糖消耗殆盡后菌體細胞對果糖代謝利用能力得到增強，最終提高了果糖利用效率，但是相關調控機制尚不明確。

3 結 論

表2 葡萄糖與果糖不同混合比例對丁醇發酵性能的影響

以混合糖模擬菊芋物料為底物的丁醇發酵存在果糖利用效率及丁醇產量較低等問題，嚴重影響了發酵效率。對于C.acetobutylicum來說，雖然葡萄糖與果糖均利用均依賴磷酸轉移酶系統（PTS）進行，但是二者仍有不同，且在細胞內吸收代謝速率具有較大差異，在本實驗中，針對不同葡萄糖/果糖比例的丁醇發酵，發酵前期葡萄糖表現一定的阻遏效應，盡管二者一定程度上亦能同步利用，直至葡萄糖消耗殆盡前，果糖代謝利用相對緩慢。本實驗進一步通過提高葡萄糖與果糖的混合比例，有效地縮短了發酵周期，由76h縮短至48h，同時菌體最大生物量大幅度提高，OD620由2.1提高至4.3。值得注意的是，當葡萄糖與果糖比例為1∶2時，后期果糖利用階段菌體細胞呈現出典型的二次生長狀態，能量代謝活性相對增強，對于后續果糖代謝利用及溶劑合成具有重要促進作用，在保證果糖利用的同時，發酵終點殘糖有效降低，丁醇等溶劑代謝得到順利進行。最終果糖利用效率達到95.03%，而丁醇及總溶劑產量也分別達到了9.7g/L與16.0g/L，有效地提高了丁醇發酵效率。相反，當進一步提高葡萄糖/果糖比例時，葡萄糖消耗殆盡后，果糖代謝利用能力依舊不足，發酵終點果糖殘糖濃度較高，丁醇等溶劑產量有所下降。以上研究結果為探究葡萄糖及果糖代謝利用機制提供了重要的理論依據，也為菊芋物料或混合糖模擬物料發酵生產丁醇奠定了堅實的基礎。

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