貫葉連翹提取物對Beagle犬長期毒性研究

謝家駿, 周光興, 喬正東, 王建新

（1. 上海中醫藥大學, 上海　201203; 2. 復旦大學實驗動物科學部, 上海　200032; 3. 上海市中藥研究所, 上海　201401; 4. 復旦大學藥學院, 上海　201203)

貫葉連翹提取物對Beagle犬長期毒性研究

謝家駿1, 周光興2, 喬正東3, 王建新4

（1. 上海中醫藥大學, 上海201203; 2. 復旦大學實驗動物科學部, 上海200032; 3. 上海市中藥研究所, 上海201401; 4. 復旦大學藥學院, 上海201203)

目的觀察貫葉連翹提取物經口給藥9個月對Beagle犬長期毒性反應。方法選用Beagle犬28條，隨機分為4組，每組6～8條，雌雄各半。以0.3、0.55、1.0g/kg劑量的貫葉連翹提取物(膠囊)經口給藥，每日1次，每周6次，連續38周，停藥恢復期8周。在整個實驗期間，每日觀察受試動物的一般活動狀況，每周稱體質量1次，并于給藥前、給藥10、20、30、38周、停藥8周時，作心電圖(Ⅱ導聯ECG)檢查，前肢抽血作血液學和血清生化學檢測，收集尿液作尿常規檢驗，給藥20、38周、停藥8周時，處死部分動物取主要臟器和組織稱重，并作組織形態學檢查。結果在給藥10、20、30、38周和停藥恢復期8周時，各劑量組和對照組動物一般活動狀況、心電圖檢查、血液學和尿常規檢測均未見有明顯的異常改變。但在給藥20、30周時高劑量組動物ALP、給藥38周時中、高劑量組TBIL升高(P＜0.05或P＜0.01)，屆時，高劑量組動物肝臟系數上升(P＜0.05)。病理檢查亦顯示，給藥20周時，高劑量組雌、雄各有1條動物肝細胞輕度顆粒變性，雌性有1條腎曲管輕度顆粒樣變性;給藥38周時，僅高劑量組動物少量肝細胞或腎近曲小管有輕度顆粒樣變性。其余各劑量組動物各時點的血液學和血清生化學指標、臟器系數、組織形態學變化與相應對照組比均無顯著性差異(P＞0.05)。結論貫葉連翹提取物連續給藥20、38周時，0.55、1.0g/kg組Beagle犬肝、腎組織形態和功能呈現輕度的毒性反應，但停藥后可隨時間而逐步恢復正常，其毒性反應程度與給藥劑量和服用持續時間呈正相關。貫葉連翹提取物經口給Beagle犬的安全劑量為0.3g/kg，相當臨床治療抑郁癥擬用劑量的40倍。

貫葉連翹提取物; 長期毒性試驗; 肝毒性; 腎毒性

貫葉連翹(Hypericum perforatumL.) 為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物, 主要含有黃酮類化合物(Flavonoids)、苯并二蒽酮類化合物(Naphthodianthrones)、間苯三酚類化合物(Phloro glucinols)等成分[1～2]，具有抗抑郁[3～4]、抗菌抗病毒[5～6]、抗癌等活性[7～8]。貫葉連翹提取物是基于貫葉連翹植物中藥效活性成分而提取富集的抗抑郁中藥有效部位。前期研究結果顯示，該提取物抗抑郁活性強、有效成分含量高，其中黃酮類成分含量達到50%[9]。為了確保其臨床用藥的安全性，本文在先期試驗發現長期灌胃給藥可致大鼠肝腎出現損傷[10]的基礎上，以Beagle犬為受試對象，就其連續9個月給藥可能出現的毒性反應進行全面觀察。

1　材料與方法

1.1實驗動物

普通級Beagle犬，雌雄各半,實驗開始時為6月齡，體質量9.08±1.27 kg，其中雄性為9.66± 1.28 kg，雌性為8.50±0.99 kg，由上海新岡實驗動物場提供[SCXK(滬)2002-0014]。飼養環境:室溫20～24℃, 相對濕度45%～70%, 照度＞150 Lux, 12 h明暗交替。飼喂Beagle犬專用飼料，由復旦大學實驗動物科學部提供。

1.2受試物

貫葉連翹提取物: 浸膏干粉, 深褐色, 味微苦、微澀。含量檢測: 總黃酮以蘆丁計為61.14%，苯并二蒽酮類以金絲桃素計為1.76%, 由中藥研究所植化室提供, 批號001227。實驗前, 將受試物及不同比例受試物與淀粉混合物裝入0號膠囊, 500 mg/粒,空白對照膠囊則將淀粉裝入0號膠囊, 500 mg/粒,置干燥箱內避光冷藏。

1.3檢測儀器

血液分析儀(SYSMEX F-800，日本東亞公司);生化分析儀(COBAS EM IRA PLUS，瑞士羅氏公司);尿液分析儀(MA-4210，桂林市華通醫用儀器有限公司); 心電圖機(model ECD-6511, 日本光電公司)。

1.4實驗方法

1.4.1分組及給藥設受試物高、中、低三個劑量組, 分別吞服相當貫葉連翹提取物1.0 g/kg、0.55 g/kg、0.30 g/kg的受試物膠囊2.0粒/kg，每日1次，每周6次, 連續38周, 停藥恢復期觀察8周。其中, 高、中、低劑量組單日用藥劑量分別為臨床擬用劑量的133、73、40倍。另設空白對照組，吞服空白對照膠囊2.0粒/kg。每周稱體質量調整給藥量。

1.4.2操作步驟給藥及恢復期間，每日觀察動物的一般癥狀，每周稱體質量、食耗量1次。在給藥10、20、30、38周和停藥恢復期8周時，檢測心電圖; 禁食不禁水12 h后，收集尿液作尿液常規檢查，股動脈取血作血液學和血清生化學檢查;在給藥20、38周和停藥恢復期8周時, 分別取8/28、12/28、8/28只動物, 禁食不禁水12 h, 1%戊巴比妥鈉麻醉后放血處死作系統尸解，摘取主要臟器作肉眼檢查, 稱量重要臟器換算成臟器系數，同時取各器官組織作石蠟切片、H.E染色及組織學鏡檢。

1.4.3檢測項目1) 一般癥狀: 外觀體征, 行為活動,體質量變化，攝食情況, 糞便性狀等。2) 心電圖(Ⅱ導聯ECG): 心率(次/min)，心律，PR間期(ms), QRS間期(ms), ST-T形態, T波(mv)。3) 血液學: 紅細胞數(RBC), 紅細胞壓積(HCT), 紅細胞平均體積(MCV), 血紅蛋白(HGB), 紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC), 凝血時間(CT), 血小板數(PLT), 網織紅細胞(RET), 白細胞數(WBC), 及白細胞分類(N、L、 E、B、M)。4)血清生化: 天門冬氨酸轉氨酶(AST)，丙氨酸轉氨酶(ALT), 總膽固醇(TCHO), 總膽紅素(TBIL)，堿性磷酸酶(ALP), 血糖(GLU), 總蛋白(TP)，白蛋白(ALB)，尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)。5) 尿液: 尿蛋白(PRO), 尿膽元(URO)，亞硝酸鹽(NIT)，膽紅素(BIL), 酮體(KET), 隱血(BLD),尿糖(GLU), 酸堿值(PH)。6) 系統尸解: 取主要臟器作肉眼檢查。7) 臟器系數: 腦、心, 肺, 肝, 脾, 腎,腎上腺, 甲狀腺, 子宮, 卵巢, 前列腺, 睪丸。稱取重要臟器濕重，換算臟器系數。臟器系數(%)=臟器重量(g)÷體質量(kg)×100%。8) 組織學鏡檢: 腦,小腦, 垂體, 脊髓, 視神經, 甲狀腺, 胸腺, 胸骨, 心, 肺,肝, 脾, 胰腺, 胃, 十二指腸, 回腸, 結腸, 腎, 腎上腺, 前列腺, 睪丸, 附睪, 子宮, 卵巢, 膀胱, 淋巴結。取材10%甲醛固定, 石蠟切片, H.E染色, 組織學鏡檢。

1.4.4數據統計計量資料多組間均數比較，方差齊性時采用方差分析，方差不齊時采用非參數檢驗; 計數資料多組間均數比較，采用χ2檢驗。

2　結果

2.1一般癥狀

受試物各劑量組及空白對照組Beagle犬活動正常，糞便成形，在整個實驗過程中，無動物死亡，亦未發生明顯的異常反應。

2.2體質量變化

給藥4、10周后, 高、中劑量組Beagle犬體質量增長分別開始出現變緩狀態; 給藥30周后, 中劑量組Beagle犬體質量增長速度開始回升, 給藥32周時已與空白對照組Beagle犬體質量平均值近似。停藥后，中、高劑量組Beagle犬體質量增長開始加快，恢復期4～8周時體質量平均值已達到或高出空白對照組(圖1)。

2.3心電圖檢測

給藥20、40、38周及停藥8周時，各用藥組Beagle犬心電圖各項指標平均值與相應對照組比均無顯著性差異(P＞0.05)。

2.4血液學檢測

給藥20、40、38周及停藥8周時，各用藥組Beagle犬血液學各項指標平均值與相應對照組比均無顯著性差異(P＞0.05)。

2.5血清生化檢測

圖1　貫葉連翹提取物對Beagle犬體質量經時變化的影響Figure 1　Effect of Hypericum perforatum extract on the change of food consumption of Beagle dogs w ith time

給藥20周時高劑量用藥組Beagle犬ALP、給藥30周時中劑量用藥組Beagle犬TBIL、BUN、CREA、高劑量用藥組Beagle犬TCHO、TBIL、ALP、BUN、CREA、給藥38周時中劑量組Beagle犬的TBIL、高劑量組Beagle犬的ALT、TCHO、ALP、BUN、TBIL均呈一定的升高趨勢，其中，給藥20、30周時高劑量用藥組Beagle犬ALP、給藥38周時中、高劑量組Beagle犬的TBIL與空白對照組比差異顯著(P＜0.05或P＜0.01)。恢復期停藥8周時高劑量組Beagle犬ALT、TCHO、ALP雖仍稍有升高，但無統計學意義(P＞0.05)。其余各劑量組Beagle犬各時點各項血清生化學指標平均值與相應對照組比均無明顯差異(P＞0.05)(表1)。

2.6尿液檢測

給藥20、40、38周及停藥8周時，各劑量用藥組Beagle犬尿液各項指標平均值與相應對照組比均無顯著性差異(P＞0.05)。

表1　貫葉連翹提取物對Beagle犬血清生化學指標的影響Table 1 Effect of hypericum extracts on serum biochem ical indexes of Beagle dogs

續表1

2.7大體尸檢

給藥期20、38周和停藥恢復期9周時, 受試動物心、肝、腺、肺、腎、腦、垂體、視神經、脊髓、甲狀腺、胸骨、胸腺、胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸、胰腺、腎上腺、淋巴結、子宮、卵巢、睪丸、附睪、前列腺、膀胱等組織器官的外形、顏色、質地均未見有明顯的異常。

2.8臟器濕重和臟器系數

給藥20周時, 低、高劑量組受試動物肝、脾系數呈一定的升高趨勢, 其中, 低、高劑量組肝臟系數與空白對照組比升高顯著(P＜0.05); 給藥38周時,低、中劑量組受試動物肝、脾系數、高劑量組肝、肺、腎、子宮系數上升, 其中, 高劑量組肝、子宮上升程度與空白對照組比具有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01); 停藥8周時, 中劑量組脾臟系數下降(P＜0.05)。其余各劑量組受試動物各時點各臟器濕重平均值與相應對照組比均無顯著性差異(P＞0.05)(表2)。

表2　貫葉連翹提取物對Beagle犬臟器系數的影響Table 3 Effect of hypericum extracts on organ coefficients of Beagle dogs

2.9病理學檢查

在給藥20周時，高劑量組雌、雄動物各1條有肝細胞輕度顆粒變性，雌性動物1條有腎曲管呈輕度顆粒樣變性；給藥38周時，高劑量組動物除少量肝細胞有輕度的顆粒樣變性、腎近曲小管呈現輕度顆粒樣變性以外，其余各組動物肝小葉結構清晰，肝細胞呈索狀排列，腎臟皮質與髓質分界清楚，腎小球與腎曲管結構清晰，未見異常病變; 停藥恢復期8周時，肝、腎組織均未見有明顯的異常。其他器官和組織在給藥20、38周和停藥恢復期8周時，均未見有明顯的異常。動物重要器官如心內外膜光滑，心肌纖維結構清晰; 脾臟被膜及小粱染色好，脾實質紅髓及白髓形態完好，結構清晰; 肺支氣管結構完好，肺泡腔張力好，腔內無滲出物，粘膜無損傷; 腦皮質與髓質結構清晰, 神經元突起形態完好，大腦海馬神經細胞正常, 腦組織中神經膠質細胞無異常; 子宮組織結構完好, 子宮內膜、肌層及子宮腺體均未見有異常病理改變。

3　討論

貫葉連翹提取物作為治療抑郁癥的中藥有效部分, 主要活性成分包括金絲桃素, 偽金絲桃素, 貫葉金絲桃素, 金絲桃甙, 蘆丁，槲皮素，阿曼托黃素等[2]。前期研究顯示，貫葉連翹提取物可減少小鼠懸尾不動時間，減少大鼠強迫游泳不動時間，增強5-羥色胺酸甩頭行為，加強阿樸嗎啡降溫強度，其作用機制與通過對腦內5-HT、NE和DA等神經遞質重攝取具有抑制作用有關[11]，但長期大劑量灌胃給藥可致大鼠肝腎出現損傷[10]。對此，本實驗選用Beagle犬作深入的長期給藥的安全性評價。

結果顯示，給藥20周時，低劑量組動物的肝臟系數、高劑量組動物ALP升高，給藥30周時，除高劑量組ALP繼續升高外，中劑量用TB IL、BUN、CREA、高劑量組TBIL、BUN、CREA、TCHO亦呈升高趨勢，屆時，高劑量組肝臟系數明顯升高，病理檢查亦發現高劑量組有動物出現肝細胞輕度顆粒變性，腎曲管輕度顆粒樣變性，但低劑量組動物的血液生化指標和肝臟組織形態學均未發現有明顯變化; 給藥38周時, 在原有中、高劑量組ALP、TBIL、BUN、TCHO升高的同時, ALT亦呈現一定的升高趨勢，高劑量組肝臟系數繼續處于明顯高企的狀態，病理檢查亦顯示高劑量組動物肝細胞和腎近曲小管有輕度顆粒樣變性。恢復期停藥8周時, 上述各項指標均逐步恢復正常。其余各劑量組動物各時點的一般活動狀況觀察, 心電圖、血液學、血清生化學和尿常規檢測[12～14], 系統尸解及病理檢查結果, 與相應對照組比均無顯著性差異。分析認為，低劑量組動物的肝臟系數升高可能因個體差異所致，與受試藥物因素無關，而中、高劑量動物的各項指標變化則與受試藥物相關。其結果與長期大劑量灌胃給SD大鼠試驗結果相吻合。

實驗結果提示, 貫葉連翹提取物以相當0.3 g/kg、0.55 g/kg、1.0 g/kg劑量經口給Beagle犬吞服, 每日1次, 每周6次, 在連續給藥20、30、38周時發現0.55 g/kg、1.0 g/kg組Beagle犬肝、腎組織形態和功能呈現輕度的毒性反應，但停藥后可隨時間而逐步恢復正常，其毒性反應程度與給藥劑量和服用持續時間呈正相關。貫葉連翹提取物經口給Beagle犬的安全劑量為0.3 g/kg, 相當臨床治療抑郁癥擬用劑量的40倍。

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Studies on Chronic Toxicity of Hypericum Perforatum Extract on Beagle Dogs

XIE Jia-jun1, ZHOU Guang-xing2, QIAO Zheng-dong3, WANG Jian-xin4
(1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China; 2. Department of Laboratory Animal Science, Fudan University, Shanghai 200032, China; 3. Shanghai Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai 201401, China; 4. School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 201203, China)

ObjectiveTo investigate the chronic toxicity of Hypericum perforatum extract through oral administration for 9 months on Beagle dogs.MethodsTwenty-eight Beagle dogs were random ly divided into blank control group and low, middle and high dose groups,which were treated respectively w ith Hypericum perforatum extract (0.3, 0.55, 1.0 g/kg) by oral administration, once a day, 6 times weekly for 38 weeks. During the whole experimental period, the Beagle dogs were treated w ith Hypericum perforatum extract through deglutiatur administration once a day for successive 38 weeks, meanwhile the activities of the dogs were observed once a day, the body weight were weighed weekly. Electrocardiographic examination, blood counts determination, serum biochemical measurement, urinalysis test and histomorphologic observation were conducted on the 10th, 20th, 30th, 38th week w ith successive administration and on the 46th week w ithout administration for 8 weeks. Some animal in each group were sacrificed, whose organs and tissues were harvested, of which the main ones were weighted and examined histopathologically on the 20th, the 38th week w ith administration and the 46th week w ithout administration for 8 weeks.ResultsDuring the whole experimental period, the animal activities, electrocardiographic examination, blood counts determination and urinalysis test showed no obvious abnormalities. But ALP increased in blood of the Beagle dogs in the 1.0 g/kg groups on the 20th and the 30th week w ith administration, TBIL increased in the 0.55 g/kg and 1.0 g/kg groups on the 38th week (P＜0.05 or P＜0.01). Meanwhile, liver coefficient increased in the 1.0 g/kg groups (P＜0.05) on the 20 th, 38th week after administration. Pathological examination showed that slightly granular degeneration appeared in the liver cells of 2 animals (1♀,1♂) and in the renal tubules of 1 animal (♀) in the 1.0 g/kg groups on the 20th and 38th weeks, regardless of sex. There was no significant difference between the rest of the treatment groups and the corresponding control group in hematological and serum biochemical indexes, the organ coefficient, the morphological changes (P＞0.05).ConclusionSome mild toxic effects on the liver and kidney function or organization were found on the 20th and 38th week when the Beagle dogs were treated w ith Hypericum perforatum extract (0.55, 1.0 g/kg) through successive oral administration once a day for 38 weeks , but could disappear gradually over time after w ithdrawn. The degree of toxicity was positively correlated w ith the dose of administration and the medication cycle. The safe dosage of Hypericum perforatum extract by intragastric administration is 0.3 g/kg, equivalent to 40 times of clinical depression treatment dose.

Hypericum perforatum L; Chronic toxicity test; Liver toxicity; Renal toxicity

R996Q95-33

A

1674-5817(2014)01-0018-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.004

2013-08-12

國家“十二五”科技重大專項課題(2011ZX09301-009)

謝家駿(1959-), 男, 研究員, 碩士生導師。研究方向: 藥理毒理學研究與中藥新藥開發。E-mail: xiejj001@163.com