micro-CT法觀測雌性小鼠股骨骨參數(shù)的分析

耿 沁， 朱淼鑫， 孫 磊， 崔永奇， 孔韓衛(wèi)， 姚 明， 劉 蕾

(上海市腫瘤研究所癌基因及相關(guān)基因國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200032)

micro-CT法觀測雌性小鼠股骨骨參數(shù)的分析

耿 沁， 朱淼鑫， 孫 磊， 崔永奇， 孔韓衛(wèi)， 姚 明， 劉 蕾

(上海市腫瘤研究所癌基因及相關(guān)基因國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200032)

目的 利用小動(dòng)物CT(micro-CT)收集正常雌性BALB/c-nu/nu小鼠與BALB/c小鼠股骨的影像學(xué)數(shù)據(jù)。方法 BALB/c-nu/nu小鼠與BALB/c小鼠各15只，雌性，10～12周齡，取股骨后用micro-CT進(jìn)行掃描，將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析。結(jié)果 成功收集了正常雌性BALB/c-nu/nu小鼠與BALB/c小鼠股骨的CT影像學(xué)數(shù)據(jù)。通過數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)兩者在皮質(zhì)骨相對骨體積上具有顯著差異,在骨小梁相對骨體積、骨表面積與組織體積比值和骨密度也有顯著差異。結(jié)論 micro-CT可以對雌性小鼠股骨的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行定量分析。

micro-CT; 股骨; 小鼠; 雌性

隨著全球人口老齡化, 骨質(zhì)疏松已成為挑戰(zhàn)人類健康、威脅老年人生活的主要疾病之一[1], 其中女性的發(fā)病率是男性的3～5倍。小鼠是生命科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究的重要模式生物, 文獻(xiàn)表明, 已有不少小鼠模型廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松研究的各個(gè)方面[2～4]。

以往的骨結(jié)構(gòu)研究主要是將骨組織進(jìn)行切片，從而得到掃描圖像，通過數(shù)學(xué)模型的建立以計(jì)算骨的各項(xiàng)指標(biāo)[5]。目前，小動(dòng)物CT(m icro computed tomography，微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù))的應(yīng)用不僅可以在活體上研究骨的微結(jié)構(gòu)，更能夠進(jìn)行骨骼圖像的三位重建，還可以定量分析骨的各項(xiàng)參數(shù)。正是基于micro-CT在骨分析中的優(yōu)勢，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松等的藥物開發(fā)及臨床前研究[6,7]。

對于骨質(zhì)疏松的診斷，需要正常群體的骨參數(shù)，但目前尚未找到小鼠骨參數(shù)正常值的報(bào)道。股骨是骨質(zhì)疏松導(dǎo)致病理性骨折的高發(fā)部位[8], 而女性又是骨質(zhì)疏松高發(fā)病人群，因此本研究以雌性小鼠股骨為研究對象，使用micro-CT分析了股骨的皮質(zhì)骨和骨小梁各項(xiàng)指標(biāo)，探討建立相應(yīng)的操作方法及收集正常雌性小鼠股骨數(shù)據(jù)，為小鼠骨質(zhì)疏松模型的研究提供可參考的正常股骨數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級雌性BALB/c小鼠15只, 10～12周齡(體質(zhì)量22～24 g); SPF級雌性BALB/c-nu/nu小鼠15只，10～12周齡(體質(zhì)量20～22 g), 均由上海市腫瘤研究所提供[SCXK(滬)2012-0001]，實(shí)驗(yàn)操作及動(dòng)物飼養(yǎng)嚴(yán)格按照SPF級標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行[SYXK (滬) 2012-0001]。

1.1.2 儀器 比利時(shí)產(chǎn)小動(dòng)物micro-CT成像系統(tǒng)，型號: SkyScan 1076。

1.2 方法

BALB/c-nu/nu小鼠與BALB/c小鼠各15只, 麻醉處死后切取股骨固定于無水乙醇中。然后用小動(dòng)物micro-CT進(jìn)行掃描, 掃描條件為: 電壓 (kV): 40, 電流 (μm): 250, 慮片: 無, 分辨率 (μm): 18.26017, 步長(deg): 0.6000。掃描后將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。骨分析參數(shù)所表示的意義，TV: 選取ROI體積; BV: 骨體積; BV/TV: 相對骨體積; TS: 選取ROI面積; BS: 骨表面積; BS/BV: 骨表面積和骨體積的比值; BMD: 骨密度; BS/TV: 骨表面積和組織體積的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 小鼠股骨不同角度平掃圖

2 結(jié)果

使用micro-CT對小鼠股骨進(jìn)行掃描并三維重建, 對骨結(jié)構(gòu)的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行分析。

2.1 股骨掃描圖片

取小鼠股骨，經(jīng)m icro-CT掃描并三維重構(gòu)，BALB/c-nu/nu小鼠和BALB/c小鼠掃描圖片無明顯差別(圖1、圖2), 其中, 三維重構(gòu)圖為股骨頭曲近至遠(yuǎn)的冠狀截面圖。

圖2 小鼠股骨三維重構(gòu)后不同位置的冠狀面圖

表1 雌性BABL/c-nu/nu小鼠與BALB/c小鼠股骨掃描結(jié)果及比較

2.2 股骨掃描結(jié)果及比較

皮質(zhì)骨中，雌性BABL/c-nu/nu小鼠與BALB/c小鼠在相對骨體積上具有顯著差異。骨小梁中, 雌性裸小鼠與BALB/c小鼠在相對骨體積、骨表面積與組織體積比值和骨密度具有顯著差異(圖2, 表1)。

3 討論

micro-CT技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)對小動(dòng)物活體研究最重要的工具之一[9]。它與普通臨床CT最大的差別在于分辨率極高, 可以達(dá)到微米(μm)級別，能區(qū)分體內(nèi)各種組織的密度并對其作定量測定; 同時(shí)由于其能消除前后組織的重疊, 從而可以清楚地進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)的造影，顯示動(dòng)物解剖結(jié)構(gòu)和生理功能。目前，m icro-CT技術(shù)在很大程度上取代了破壞性的組織形態(tài)計(jì)量學(xué)方法。隨著各種疾病動(dòng)物模型的建立，對動(dòng)物模型的診斷、治療的評估也顯得越來越重要，其中在各類創(chuàng)傷及疾病引起的骨性病理性損傷也越來越受到人們的重視[10]。

micro-CT在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用領(lǐng)域主要有骨研究(如骨小梁)、牙齒及牙周組織研究、生物材料(如仿生材料生物支架的孔隙率、強(qiáng)度等)、疾病機(jī)制研究(如疾病狀態(tài)對骨骼發(fā)育、修復(fù)的影響)、新藥開發(fā)(如骨質(zhì)疏松癥及療效評價(jià)), 主要是對活體小動(dòng)物、硬組織和相關(guān)軟組織的掃描成像分析，集中于骨領(lǐng)域研究[11], 這主要源于骨骼和空氣及周圍軟組織之間良好的對比性。micro-CT能夠在不損毀樣品的情況下, 對活體小動(dòng)物、骨骼、牙齒和各種生物材料進(jìn)行高分辨率X射線成像。其中, 骨骼是micro-CT最主要的應(yīng)用領(lǐng)域之一[12～15], 而骨小梁又是主要研究對象[16], 此外數(shù)據(jù)分析軟件中包括多達(dá)16項(xiàng)(如BMC、TMD、BV、Yb.N、Tb.Th等)的骨參數(shù)分析。

micro-CT在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或者小型標(biāo)本的骨結(jié)構(gòu)分析上具有一定的優(yōu)勢, 并且可以一次掃描同時(shí)測量骨密度及骨微結(jié)構(gòu), 在三維重建模型上得到的骨結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)更精確。傳統(tǒng)體視學(xué)方法研究只能提供某個(gè)切面的二維圖像, 而m icro-CT可以直接顯示三維結(jié)構(gòu)圖。m icro-CT還可以在三維結(jié)構(gòu)中直接測得各種數(shù)據(jù), 而體視學(xué)方法必須以平板模型為基礎(chǔ)進(jìn)行模擬計(jì)算, 顯然micro-CT的數(shù)據(jù)更為精準(zhǔn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的替代(replacement)、 減少(reduction)和優(yōu)化(refinement)(“3R”原則)[17], 實(shí)驗(yàn)中需盡量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用, 無疑micro-CT在骨研究中的應(yīng)用符合這一要求。

對于骨質(zhì)疏松的診斷，需要獲得正常群體的骨參數(shù)，其中由于股骨是骨質(zhì)疏松引發(fā)骨折的高發(fā)部位，而且女性的發(fā)病率明顯高于男性，因此作者選取了正常雌性BALB/c-nu/nu小鼠和BALB/c小鼠的股骨為觀測對象，使用micro-CT分析股骨的皮質(zhì)骨和骨小梁各項(xiàng)指標(biāo)，由此不僅獲得了正常雌性BALB/c-nu/nu小鼠和BALB/c小鼠股骨的三維成像圖，而且通過軟件分析獲得了皮質(zhì)骨和骨小梁的相關(guān)骨參數(shù)。同時(shí), 對同周齡同性別BALB/c-nu/nu小鼠和BALB/c小鼠的股骨數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠的股骨密度明顯高于BALB/c-nu/nu小鼠，而皮質(zhì)骨中BALB/c-nu/nu小鼠的相對骨體積顯著高于BALB/c小鼠，在骨小梁中則正好相反。

m icro-CT通過掃描所得的二維、三維圖像觀察到骨結(jié)構(gòu)形態(tài)，以及骨小梁的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、形態(tài)的變化情況，能夠?qū)?shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行直觀的觀察和分析，骨分析也大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，卻能獲得全面的骨參數(shù)。因此，m icro-CT在骨科研究中的應(yīng)用具有優(yōu)勢，因?yàn)樗肓诵碌膶?shí)驗(yàn)方法。總之，本次研究獲得了正常雌性BALB/c-nu/nu小鼠和BALB/c小鼠股骨的影像學(xué)數(shù)據(jù)，完善了操作條件及方法，為小鼠骨相關(guān)研究提供了參考數(shù)據(jù)。

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Analysis on Femur Bone Parameters in Female Mice by Using Micro-CT

GENG Qin, ZHU M iao-xin, SUN Lei, CUI Yong-qi, KONG Han-wei, YAO M ing, LIU Lei
(Key Laboratory of Oncogenes and Related Genes of Shanghai Cancer Institute, Shanghai 200032, China)

ObjectiveTo obtain femur bone datas about female BALB/c-nu/nu and BALB/c mice by using micro-CT.MethodsThe femur from fifteen female nude mice w ith BALB/c background and BALB/c mice respectively, aged 10-12weeks, were scanned w ith micro-CT.ResultsThe parameters of female BALB/c-nu/nu and BALB/c mice femur bone were detected by using micro-CT, there are differences of femur bone in some parameters between BALB/c-nu/nu and BALB/c mice. In the vortical bone, there is significant difference in BV/TV. In the trabecular bone, BV/TV, BS/TV and BMD have significant difference.ConclusionsM icro-CT can be used for quantitative analysis of mice femur bone parameters.

M icro-CT; Femur; Mice; Female

Q95-33

A

1674-5817(2014)01-0046-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.009

2013-08-08

上海市科委創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃(11140902100)

耿 沁(1974-), 男, 主管技師, 研究方向: 小動(dòng)物影像學(xué)技術(shù)在動(dòng)物模型中的應(yīng)用, E-mail: gq888899@163.com

劉 蕾, E-mail: leilei_liu@126.com