神經(jīng)干細胞定向分化過程中編碼基因表達譜分析

張 靖，朱麗媛，陰 彬，侯 琳，彭小忠，2*

（中國醫(yī)學科學院1.基礎醫(yī)學研究所北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室;2.神經(jīng)科學中心，北京 100005）

哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的早期發(fā)育包含一個重要的生物學事件即神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）定向分化為神經(jīng)元和其他類型的神經(jīng)細胞。這種時空嚴格限定的分化調(diào)控機制至今仍為神經(jīng)發(fā)育研究領域關注的重要科學問題［1-2］。一些重要的編碼基因在時間和空間上形成復雜的交互作用，共同完成對干細胞命運決定的促進與協(xié)調(diào)［3］。

本研究從神經(jīng)干細胞定向分化為神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞等不同的神經(jīng)細胞類型過程中全基因編碼基因的表達譜篩查入手，驗證了一些已知的神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞特異表達基因的特征，同時也分析了基因組范圍內(nèi)編碼基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達變化特點。從中歸納出一些神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育重要通路，如Wnt、Insulin等通路，均在此生物學過程中發(fā)生了明顯的變化。提示神經(jīng)干細胞的分化過程是一個多基因通路綜合變化的復雜網(wǎng)絡。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級12周齡ICR孕鼠［由北京大學醫(yī)學部動物中心提供，合格證號:SCXK（京）2006-0008］。

1.2 神經(jīng)干細胞培養(yǎng)及誘導分化

參考本研究前期已發(fā)表文獻［4］。

1.3 流式細胞法分析、分選神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元細胞及星形膠質(zhì)細胞

實驗相關抗體（BD公司）:CD15（#560127）、CD24（#553262）、CD44（#560568）和 CD184（#558644）。

神經(jīng)干細胞分化7 d后，分別使用細胞表面標志物組合分選，獲得了 CD24+/15low的神經(jīng)元及CD184+/CD44+/CD24－/CD15－的星形膠質(zhì)細胞。細胞消化、多重抗體標記及流式分析分選步驟按照公司提供標準實驗方案進行。

1.4 Arraystar基因芯片篩查

本實驗委托上海康成生物工程有限公司進行芯片雜交反應及芯片數(shù)據(jù)的初步整合分析。實驗所使用芯片類型為NEW Mouse LncRNA Array V2.0（8x60K），其中包括31 423個 LncRNAs和25 376個編碼基因的篩查。

1.5 生物信息學分析

編碼基因功能注釋:DAVID 6.7（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）;KEGG PATHWAY Database（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）。

芯片表達數(shù)據(jù)聚類分析:Cluster 3.0。

2 結(jié)果

2.1 編碼基因在不同分化細胞類群中的變化特點

與NSC相比，分化7 d的神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細胞中，表達水平改變（2倍以上變化率）的mRNAs的總數(shù)依次為4 407和2 874個;其中在神經(jīng)元中表達上調(diào)的基因有2 751個，在星形膠質(zhì)細胞上調(diào)的有1 494個;在神經(jīng)元中下調(diào)有1 656個，星形膠質(zhì)細胞中下調(diào)1 380個。同時，在上調(diào)的基因群中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞共變的有189個;下調(diào)基因中二者共變的有288個。

本研究著重分析了芯片中重要的神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞標記分子的表達變化情況（圖1）。

圖1 芯片中NSCs特定分化型細胞中星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元標記分子的表達Fig 1 The histograms are displayed marker genes of NSCs，neurons and astrocytes are specifically expressed in corresponding cell types

通過對圖1中NSCs干性維持標記分子（Sox2、Nestin）在分化前后細胞內(nèi)表達水平的比較可以看出，隨著NSCs分化進程的深入，干性標記分子的表達持續(xù)下降;神經(jīng)元標記分子（Sema4f、Tubb3、Grid1）在神經(jīng)元和NSCs及星形膠質(zhì)細胞中存在明顯的表達差異;同樣，星形膠質(zhì)細胞的標記分子（Stat3、Gfap）在星形膠質(zhì)細胞中出現(xiàn)了明顯的上調(diào)，而在NSCs及神經(jīng)元中則維持很低的水平。

2.2 Wnt、Insulin通路活性分別在神經(jīng)分化、膠質(zhì)分化中特異性增強

本研究進一步通過基因調(diào)控通路分析（pathway analysis）的分析方法發(fā)現(xiàn)，一些比較明確的基因調(diào)控通路NSCs與神經(jīng)元/星形膠質(zhì)細胞之間、神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞之間存在顯著差異（圖2，3）。

在星形膠質(zhì)細胞中，經(jīng)典Wnt通路上的多個基因表達活性與NSCs相比明顯增強:Fzd1（NM_021457;7.14倍）、Fzd2（NM_020510;2.5倍）Fzd6（NM_001162494;2.14倍）、Fzd7（NM_008057;3.18倍）、Fzd8（NM_008058;10.12 倍）、Gbp2（NM_010260;2.04倍）、Apc2（NM_011789;2.44 倍）、Map3k7（NM_172688，Tak1;2.01 倍）、Jun（NM_010591;5.85倍）。而非經(jīng)典Wnt（PCP）通路中與NSCs相比明顯表達增強的有:Vangl2（Stbm，NM_033509;2.45 倍）、Mapk8ip3（NM_001163448，3.0倍;NM_013931，2.21 倍;NM_001163447，2.9 倍）。鈣離子依賴的Wnt通路中明顯表達增強的有:Plcb1（NM_001145830;2024倍）、Camk2a（NM_009792;2.79倍）。

其次，在分化的神經(jīng)元中，Insulin通路上節(jié)點基因的特異增強也是一個顯著的特點:Irs2（NM_001081212;3.16倍）、Socs1（NM_009896;5.68倍）、Socs3（NM_007707;15.27 倍）、Socs4（NM_080843;4.18倍）、Socs5（NM_019654;2.04倍）、Foxo1（NM_019739;2.38 倍）、Pik3r1（P13K，NM_001077495;2.14倍）、Phka2（NM_001177879;2.75 倍）、Phkg1（NM_011079;9.83倍）、Eif4e（NM_007917;2.95倍）、Grb2（NM_008163;2.91倍）、Hras1（NM_008284;2.35倍）、Araf（NM_001159645;2.83倍）、Braf（NM_139294;2.24 倍）、Mapk1（NM_001038663;2.01倍）。

2.3 P53通路活性在神經(jīng)分化、膠質(zhì)分化中共同下調(diào)

與上述Wnt、Insulin通路不同，NSCs分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的過程中，P53通路上一些節(jié)點基因的表達則呈現(xiàn)下調(diào)的特征。與NSCs相比，星形膠質(zhì)細胞（圖4）中P53通路上的Trp53（NM_001127233;0.14 倍）、Gtse1（P99，NM_013882;0.15倍）、Pmaip1（Noxa，NM_021451;0.31 倍）、Perp（NM_022032;0.28倍）、Igfbp3（NM_008343;0.37倍）、Igf1（NM_184052;0.16 倍）、Sesn2（NM_144907;0.12倍）、Ccng1（NM_009831;0.18倍）表達均明顯下調(diào)。

圖2 Wnt通路上一些節(jié)點基因在星形膠質(zhì)細胞中特異性表達上調(diào)Fig 2 In the Wnt pathway multiple genes are active during the NSCs differentiated to astrocytes

圖3 Insulin通路上一些節(jié)點基因在神經(jīng)元中特異性表達上調(diào)Fig 3 In the insulin pathway，multiple genes are active during the NSCs differentiated to neurons

圖4 P53通路上一些節(jié)點基因在星形膠質(zhì)細胞中特異性表達下調(diào)Fig 4 In the P53 pathway，multiple genes are silenced during the astrocytic differentiation of NSCs

在神經(jīng)元中（圖5），P53通路中以下節(jié)點基因均有明顯下調(diào):Trp53（NM_001127233;0.24倍）、Gtse1（NM_013882;0.15倍）、Igfbp3（NM_008343;0.06倍）、Ccnd1（NM_007631;0.13）、Cdk1（NM_007659;0.01）、Igf1（NM_184052;0.09 倍）、Sesn2（NM_144907;0.15倍）。

圖5 P53通路上一些節(jié)點基因在神經(jīng)元中特異性表達下調(diào)Fig 5 In the P53 pathway，multiple genes are silenced during the neuronal differentiation of NSCs

3 討論

NSCs的分化過程可以由細胞內(nèi)在的自編程特性再加上胞外的誘導信號共同推動，發(fā)育基因的有序開、關表達促進了特定細胞類型限制性的命運決定［5-7］。本研究發(fā)現(xiàn)的一批神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關基因隨NSCs的定向分化呈現(xiàn)細胞特異性變化，提示它們在NSCs細胞命運決定事件中發(fā)揮著重要作用，如在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞之間協(xié)同變化基因可能與啟動NSC分化行為有關，而二者之間相異部分的變化可能與NSCs的不同分化方向有關。

通過生物信息學分析，本研究歸納出一些重要信號通路上的節(jié)點基因在NSCs定向分化過程中出現(xiàn)細胞類群特異性的變化譜式。如P53作為重要的抑癌基因已經(jīng)得到了廣泛的研究，但是其作為NSCs自我更新、定向分化重要調(diào)控基因的功能研究是近期神經(jīng)干細胞研究領域的新的熱點問題。在體條件下，P53的失活導致NSCs自我干性維持能力的降低，從而引起NSCs的分化［8］。本研究觀察到P53通路的活性變化可能與NSCs的自我增殖特性相關，P53通路的抑制可能是 NSCs分化的必要條件。

在NSCs定向分化至神經(jīng)元與膠質(zhì)細胞的過程中，Insulin和Wnt通路的特異性活化可能促進了NSCs向神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞的分化，并參與了不同細胞類群身份確定的調(diào)控。胰島素作為一種多功能的蛋白質(zhì)激素，除了經(jīng)典的代謝調(diào)節(jié)作用外，還具有重要的促生長作用［9-11］。體外培養(yǎng)的NSCs神經(jīng)球給與胰島素可出現(xiàn)自我增殖加快的特點;而胰島素信號通路的激活可影響NSCs神經(jīng)細胞分化的效率［10-12］。另外，敲低miR-106b-25簇可以降低NSCs的自我增殖能力［13］。由于 miR-106b-25簇在胰島素/胰島素樣生長因子1（insulin/insulin-like growth factor-1，IGF）信號通路上存在一系列的靶基因，其中FoxO3作為轉(zhuǎn)錄因子影響著成體干細胞的干性及分化，并可以結(jié)合到miR-106b-25的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，從而影響著該簇miRNAs的轉(zhuǎn)錄活性，由此胰島素信號通路與miR-106b-25簇之間就形成了一個正反饋環(huán)路。本研究觀察到分化神經(jīng)元中胰島素信號通路上包括FoxO3在內(nèi)的多個節(jié)點基因被連續(xù)激活，提示該通路的激活是影響NSCs神經(jīng)分化的重要因素;同時也提示該通路可能通過一些正負反饋的形式與其他重要調(diào)控方式，如非編碼RNA的調(diào)控產(chǎn)生聯(lián)系，共同決定了NSCs的細胞命運。

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