KLF9基因腺病毒載體的構(gòu)建及其抗ROS功能

焦 濤，崔安芳，常永生

(中國醫(yī)學科學院 基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室， 北京 100005)

研究論文

KLF9基因腺病毒載體的構(gòu)建及其抗ROS功能

焦 濤，崔安芳，常永生*

(中國醫(yī)學科學院 基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室， 北京 100005)

目的構(gòu)建及鑒定KLF9基因過表達的腺病毒載體，初步研究KLF9在對抗反應活性氧方面的功能。方法克隆KLF9過表達質(zhì)粒，定向克隆入穿梭載體pAdTrack-CMV，PmeⅠ酶切線性化，轉(zhuǎn)化E.coli.BJ5183(含腺病毒載體pAdEasy-1)感受態(tài)細菌，產(chǎn)生重組腺病毒載體。重組載體經(jīng)過卡那霉素抗性篩選和限制性內(nèi)切酶分析確認重組后，再用PacⅠ線性化重組質(zhì)粒，回收，轉(zhuǎn)染293A細胞，7～12 d包裝產(chǎn)生病毒顆粒。利用H2O2和過表達KLF9的腺病毒處理體外培養(yǎng)的C57BL/6J小鼠原代肝臟細胞，實時定量PCR檢測KLF9和抗ROS基因(CAT、SOD2和GPx1)的表達。結(jié)果H2O2可以刺激C57BL/6J小鼠原代肝臟細胞KLF9和抗ROS基因的表達上調(diào)(Plt;0.05)。定量PCR以及Western blot結(jié)果顯示成功包裝過表達KLF9腺病毒，感染效率達90%以上。過表達KLF9可以上調(diào)抗ROS基因的表達水平(Plt;0.05)。結(jié)論初步認定KLF9基因可參與C57BL/6J小鼠原代肝臟細胞中抗ROS基因的調(diào)節(jié)。

KLF9；腺病毒；反應活性氧

反應活性氧(reactive oxygen species, ROS)包括超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基等。正常狀態(tài)下，氧化磷酸化過程中消耗的氧0.4%～4.0%轉(zhuǎn)化為過氧化物，并最終解毒成O2和H2O2。當機體的防御機制無法抵抗活性氧的產(chǎn)生，就會產(chǎn)生氧化應激，誘導生物大分子(如DNA、蛋白質(zhì)、脂類等)發(fā)生超氧化反應而產(chǎn)生突變或損傷，引起細胞結(jié)構(gòu)、功能破壞[1]。機體內(nèi)抗氧化防御機制主要有兩種：抗氧化酶類如超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，SOD2)、過氧化氫酶(catalase，CAT)等，非酶類分子則包括谷胱甘肽(glutathione，GSH)、硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)和維生素A、C、E等[2]。

Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子(Krüppel-like factors，KLFs)是一類Cys2/His2鋅指結(jié)構(gòu)-DNA結(jié)合蛋白[3]，在細胞的增殖、分化、凋亡[4]和組織器官發(fā)育[5]中發(fā)揮重要作用。目前的研究表明有許多KLF家族成員都與機體的能量代謝有關(guān)。Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子9(KLF9)，又稱為基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合蛋白-1(basic transcription element-binding protein-1，BTEB1)，是KLF家族中的重要成員，最初從大鼠肝臟 cDNA文庫中克隆得到[6]。但是有關(guān)KLF家族在能量代謝和ROS方面的研究鮮有文章報道。本研究初步探討KLF9在抗反應活性氧中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

KLF9擴增序列引物(Invitrogen公司)，擴增序列：5′-GAATTCCCACCATGTCCGCGGCCGCCTACA-3′(正向)和5′-CTCGAGTCACAAGGGGCTGGC-3′ (反向)，兩端分別添加KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點，C端加Flag標簽。KpnⅠ和XbaⅠ酶、T4 DNA連接酶、pyrobest Taq DNA聚合酶、dNTPs(Takara公司)。T-easy質(zhì)粒、實時定量PCR試劑盒(Promega公司)。Lipofectamine2000、細胞培養(yǎng)基DMEM、RPMI1640、 Trizol(Invitrogen公司)。pAdTrack-CMV、pAdTrack-U6、E.coli. BJ5183、DH5 感受態(tài)細菌以及人胚腎細胞系293A由本實驗室保存。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI公司)。胎牛血清、青霉素、鏈霉素(Hylone公司)。明膠和膠原酶(Sigma公司)。六周齡的雄性C57BL/6J小鼠購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心[許可證號為SCXK-(軍)2012-0004]。小鼠飼養(yǎng)和管理按照中國醫(yī)學科學院的實驗動物標準執(zhí)行。

1.2 KLF9基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及腺病毒包裝

將測序正確連接在T-easy質(zhì)粒上的KLF9酶切下來，定向插入穿梭載體pAdTrack-CMV。提取穿梭質(zhì)粒，取5 μg質(zhì)粒，經(jīng)PmeⅠ酶切7 h充分線性化，酚/氯仿抽提，溶于20 μL去離子水中。取100～500 ng酶切質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli. BJ5183感受態(tài)細菌。以500 mL LB培養(yǎng)基重懸細菌，涂于卡那霉素抗性的LB平板，置于37 ℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)16～20 h。挑取較小的克隆搖床過夜，提質(zhì)粒，經(jīng)PacⅠ酶切可得30.0和4.5 kb兩條帶，即為陽性克隆。將陽性克隆的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，提取質(zhì)粒。取12 μg所得的重組質(zhì)粒，用PacⅠ 酶切7～9 h，經(jīng)酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后，溶于去離子水。將回收質(zhì)粒以轉(zhuǎn)染密度50%～70%接種于T-25培養(yǎng)瓶的293A細胞。孵箱中培養(yǎng)10～15 d，不用換培養(yǎng)基，隔天補500 μL DMEM完全培養(yǎng)基。一般轉(zhuǎn)染5～7 d后可以通過熒光顯微鏡觀察到GFP斑。

1.3 KLF9腺病毒的擴增

轉(zhuǎn)染后10～12 d，收取細胞，轉(zhuǎn)入50 mL離心管。重懸于PBS中，在液氮和37 ℃反復凍融4次，收集病毒裂解液。第2輪擴增，加病毒裂解液到2個T-25瓶子(接種293A細胞，匯合度90%)，細胞全部呈綠色且30%～50%細胞懸浮時，收集細胞，重懸于PBS中，在液氮和37 ℃反復凍融4次，收集病毒裂解液。第3輪擴增，加病毒于10個Φ100 mm大皿中(接種293A細胞，匯合度90%)，其余步驟同第2輪擴增。

1.4 細胞培養(yǎng)及小鼠肝原代細胞處理

采用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293A細胞，培養(yǎng)基中添加100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素。細胞在37 ℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)，實驗時取對數(shù)生長期細胞。用經(jīng)典的灌流膠原酶消化法獲取成活率為90%以上的C57BL/6J小鼠肝臟原代細胞，鋪至6孔板中，用1640(10%血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉索)培養(yǎng)，在37 ℃、5% CO2的飽和濕度箱中培養(yǎng)。用濃度為1 mmol/L的H2O2處理C57BL/6J小鼠原代肝臟細胞，對照組加等量的PBS，在37 ℃、5% CO2的飽和濕度溫箱中培養(yǎng)2 h，然后棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次，換新鮮的完全培養(yǎng)基再培養(yǎng)2 h后去掉培養(yǎng)基，用1 mL Trizol提取RNA。向C57BL/6J小鼠原代肝臟細胞中加過表達KLF9的腺病毒及其對照Ad-GFP，6 h以后更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白完全表達，去掉培養(yǎng)基，用1 mL Trizol提取RNA。

1.5 總RNA提取和Real-time PCR

Trizol法提取小鼠原代肝臟細胞總RNA，紫外分光光度計定量，取2 μg總RNA，加入隨機引物用Multi Scribe反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以1 μg cDNA為模板，在CFX-96儀器(BIO-RAD公司)上進行擴增反應。條件為：95 ℃ 10 min、95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(捕捉熒光值)，循環(huán)40次，并作熔解曲線。各基因的定量PCR引物序列見表1。樣本結(jié)果以目的基因與β-actin的比值做相對定量分析，數(shù)據(jù)分析采用比較CT法，重復樣本(n=3)取平均值。

表1 實時定量PCR的引物序列

1.6 Western blot

蛋白樣品以SDS-PAGE(分離膠濃度為10%)分離；電泳結(jié)束后將凝膠中的蛋白樣品電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，電轉(zhuǎn)1.5 h，封閉液室溫封閉PVDF膜1.5 h；PVDF膜置于一抗(anti-Flag：1∶8 000)溶液中，4 ℃搖床過夜；TBST洗PVDF膜4次，每次10 min；PVDF膜與辣根過氧化物酶標記的二抗(用TBST配制的2.5% BSA以1∶5 000稀釋)室溫作用1～2 h；TBST洗PVDF膜4次，每次10 min；將ECL液體以0.1 mL/cm2膜的用量滴加在PVDF膜上，室溫1 min。迅速吸去多余的ECL液體，用保鮮膜包好PVDF膜，暗室曝光。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1H2O2刺激小鼠的原代肝臟細胞KLF9及抗ROS基因的表達上調(diào)

與對照組相比，H2O2處理的C57BL/6J小鼠原代肝臟細胞中，KLF9以及抗ROS基因的表達水平均明顯上調(diào)(Plt;0.05)(圖1)。

*Plt;0.05 compared with PBS group圖1 H2O2刺激小鼠的原代肝臟細胞抗ROS基因表達上調(diào)Fig 1 The expression of anti-ROS genes was upregualted in mouse primary hepatocytes following H2O2 treatment

2.2KLF9基因過表達腺病毒的包裝及原代肝細胞水平驗證

PCR擴增約1 000 bp片段，連接T-easy載體，經(jīng)過測序與NCBI上報導的序列一致。重組質(zhì)粒，經(jīng)PacⅠ酶切后，產(chǎn)生30.0 kb和4.5 kb左右的兩條帶。PacⅠ 線性化的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293A細胞，約7～10 d 可見明顯的擴增斑(圖2A)。實時定量PCR檢檢測，與空白對照組及感染Ad-GFP組相比，感染Ad-KLF9腺病毒組原代肝細胞中KLF9的表達量上調(diào)約20倍(Plt;0.01)(圖2B)。Western blot實驗檢測感染Ad-KLF9的原代肝臟細胞，在相對分子質(zhì)量38 ku處有一條非常特異的條帶，而感染Ad-GFP的對照組則沒有條帶(圖2C)。

A.the viral multiplied plaque when transfeced into 293A cells 8 th day(×20);B.the expression ofKLF9 in mouse primary hepatocytes infected with Ad-GFP and Ad-KLF9(*Plt;0.01 compared with Ad-GFP and blank);C.the expression ofKLF9 in protein level when infected with Ad-GFP and Ad-KLF9

圖2KLF9基因腺病毒載體的包裝驗證

Fig2TheidentificationofKLF9adenoviralvector

2.3KLF9激活小鼠原代肝臟細胞抗ROS基因的表達

與感染Ad-GFP對照組相比，過表達KLF9可以明顯誘導CAT、SOD2、GPx1等抗ROS相關(guān)基因的表達上調(diào)(Plt;0.05)(圖3)。

3 討論

反應活性氧(ROS)能與DNA、蛋白質(zhì)、脂類等反應，在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要的作用，如糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥、衰老等[7- 8]。細胞內(nèi)ROS的清除途徑主要是通過ROS去毒酶，包括谷胱甘肽過氧化物酶(GPxl)和超氧化物歧化酶(SODs)等[1]。

*Plt;0.05 compared with Ad-GFP圖3 KLF9上調(diào)小鼠原代肝細胞抗ROS基因的表達Fig 3 The expression of anti-ROS genes in mouse primary hepatocytes infected with Ad-GFP and Ad-KLF9

研究表明有許多KLF家族成員包括KLF2、KLF5和KLF15參與脂代謝。例如敲低KLF4可以影響脂肪合成[9]。KLF5敲除小鼠的白色脂肪組織發(fā)育不良，而且過表達KLF5可以促進前脂肪細胞3T3-L1的分化。而KLF5又可以與C/EBPβ相互作用，從而促進PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ)基因的表達[10]。這些KLF家族在脂肪細胞中的作用提示KLF9很可能在能量代謝ROS清除中起作用。

本研究首先用H2O2刺激C57BL/6J小鼠的原代肝細胞，檢測和抗ROS相關(guān)基因的表達，然后用過表達的腺病毒感染原代肝細胞。結(jié)果顯示可通過增加細胞中清除ROS基因的表達而提高細胞的抗氧化應激能力，為其用于治療與ROS有關(guān)的疾病奠定了理論基礎(chǔ)。

腺病毒載體系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)基因在哺乳動物和細胞中高效表達，該實驗方法目前應用非常廣泛。本研究包裝成功的腺病毒感染肝原代細胞效率可以達到90%以上，為在細胞水平功能的研究提供了有力手段。而且腺病毒能夠特異且高效地感染肝臟細胞，實現(xiàn)KLF9基因在肝臟中過表達，為KLF9可能的基因治療提供了保證。

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KLF9 adenoviral vector construction and it’s function in anti-ROS

JIAO Tao, CUI An-fang, CHANG Yong-sheng*

(State Key Laboratory of Medical Molecular Biology，Institute of Basic Medical Sciences，CAMS，Beijing 100005，China)

ObjectiveTo construct the adenoviral overexpressing vector of Krüppel-like factor 9(KLF9) and to explore the role ofKLF9 in the regulation of anti-ROSgenes expression.MethodsTheKLF9 gene is cloned into the shuttle vector pAdTrack-CMV. The resultant plasmid is linearized by digesting with restriction endonucleasePmeⅠ, and subsequently cotransformed intoE.coli. BJ5183 competent cells with pAdEasy-1.Recombinants are selected for kanamycin resistance and recombination confirmed by restriction endonuclease analyses. Finally, the linearized recombinant plasmid is transfected into 293A cells. Recombinant adenoviruses are typically generated within 7 to 12 days. The mouse primary hepatocytes are isolated from the C57BL/6J mouse and subsequently H2O2treatment is conducted. We aslo performedKLF9 overexpression by using Ad-virus system (Ad-KLF9) in mouse primary hepatocytes isolated from the C57BL/6J mouse. Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analysis was further performed to determine the expression of anti-ROSgenes including catalase(CAT), manganese superoxide dismutase(SOD2) and glutathione peroxidase 1(GPx1).ResultsThe expression ofKLF9 and anti-ROSgenes were upregualted in C57BL/6J mouse primary hepatocytes following H2O2treatment (Plt;0.05).The results of qRT-PCR

and Western blot proved that adenoviral vector ofKLF9was successfully produced with 90% infection efficiency. The expression of anti-ROSgenes were also upregualted in C57BL/6J mouse primary hepatocytes after infecting with Ad-KLF9(Plt;0.05).ConclusionsKLF9 represents its impact on the expression of anti-ROSgenes.

KLF9; adenovirus; ROS

2014- 03- 08

2014- 04- 11

國家自然科學基金(81170763)

*通信作者(correspondingauthor)：changy@ibms.pumc.edu.cn

1001-6325(2014)06-0762-05

R 73

A