腫瘤微環(huán)境中乳酸對巨噬細(xì)胞表型極化和功能的影響

劉 妍，陳 翀，曹峰琦，白麗鵬，羅云萍

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 免疫學(xué)系， 北京 100005)

研究論文

腫瘤微環(huán)境中乳酸對巨噬細(xì)胞表型極化和功能的影響

劉 妍，陳 翀，曹峰琦，白麗鵬，羅云萍*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 免疫學(xué)系， 北京 100005)

目的研究腫瘤微環(huán)境中乳酸對巨噬細(xì)胞表型極化和功能的影響。方法在Balb/c小鼠乳腺處接種乳腺癌細(xì)胞4T1，研磨腫瘤組織后測其乳酸濃度。以不同濃度乳酸處理RAW264.7巨噬細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR和Western blot檢測M1、M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志分子和NFκB P50/P65。蛋白芯片檢測RAW細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。流式細(xì)胞術(shù)檢測RAW細(xì)胞吞噬功能和抗原遞呈功能。結(jié)果小鼠乳腺癌組織的乳酸濃度高于正常乳腺組織(Plt;0.05)。15 mmol/L濃度的乳酸可顯著上調(diào)RAW細(xì)胞M2型標(biāo)志分子的表達(dá)(Plt;0.05)，下調(diào)M1標(biāo)志分子的表達(dá)(Plt;0.05)，使RAW細(xì)胞分泌的M1型細(xì)胞因子明顯減少(Plt;0.05)，同時使磷酸化NFκB P65降低(Plt;0.05)。乳酸對RAW細(xì)胞的吞噬功能沒有明顯的影響，但減弱其抗原遞呈功能(Plt;0.05)。結(jié)論在乳酸的作用下，RAW巨噬細(xì)胞表型向M2型轉(zhuǎn)變，抗原遞呈功能減弱，NFκB參與調(diào)控乳酸對巨噬細(xì)胞的作用。提示腫瘤微環(huán)境中的乳酸對抗腫瘤免疫有較大影響。

腫瘤微環(huán)境；乳腺癌； 乳酸； 巨噬細(xì)胞

腫瘤中的乳酸量與多種癌癥如宮頸癌和頭頸部癌癥等的生存率成負(fù)相關(guān)，可作為惡性實(shí)體瘤的預(yù)后指標(biāo)[1]。乳酸本身有內(nèi)在炎性介導(dǎo)者的功能，它導(dǎo)致T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)IL-17A增多，促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中的慢性炎性反應(yīng)，并且和腫瘤的免疫逃逸、腫瘤發(fā)生和抗化療等直接相關(guān)[2]。近期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外的乳酸能夠抑制單個核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)的分化，并且阻礙DC釋放抗腫瘤的細(xì)胞因子[3]。分離人外周血中的CD8+T細(xì)胞并將其制備成細(xì)胞毒性T細(xì)胞后用乳酸刺激，發(fā)現(xiàn)乳酸能夠抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cell,CTL)增殖和對靶細(xì)胞的殺傷作用[4]。因此，乳酸不僅僅是腫瘤細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，在調(diào)控腫瘤微環(huán)境和抗腫瘤免疫中也發(fā)揮著重要作用。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages, TAMs)是存在于腫瘤微環(huán)境中的替代激活型巨噬細(xì)胞[5]，研究發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、血管生成以及抑制抗腫瘤免疫的功能[6]。但是影響TAMs表型和功能的因素和機(jī)制還未解釋清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)擬探索乳酸對巨噬細(xì)胞表型和功能的影響，為進(jìn)一步理解腫瘤微環(huán)境和抗腫瘤免疫提供線索。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

清潔級6～8周齡雌性Balb/c小鼠(22.8±0.2)g(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所動物中心，11400700021892)。4T1乳腺癌細(xì)胞系(AATC公司)，RAW264.7巨噬細(xì)胞系(美國The Scripps Institute Ralph.A.Reisfeld教授惠贈)。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640、胎牛血清、胰蛋白酶、細(xì)胞培養(yǎng)用雙抗(100×青霉素-鏈霉素溶液)和100×非必需氨基酸(NEAA)(Gibco公司)。乳酸(Sigma公司)。乳酸測量試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)。RNA提取試劑Trizol Reagent(Invitrogen公司)。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)。PCR試劑盒、DNA 分子量標(biāo)記和real-time PCR試劑盒(北京全式金公司)。小鼠細(xì)胞因子蛋白芯片(Ramp;D公司)。BSA-FITC(中科晨宇生物科技有限公司)。Anti-CD206-Fluor48(Biolegend公司)。流式細(xì)胞術(shù)用anti-MHC Ⅰ-PE和anti-MHC Ⅱ-PE抗體(eBioscience公司)。羊抗鼠或兔抗鼠CD206/Mrc1、Arg1、NOS2、NFκBp50/p65和β-actin抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(Santa Cruz公司)。引物合成(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

4T1細(xì)胞和RAW細(xì)胞均在含10%胎牛血清、1%雙抗(青鏈霉素溶液)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。4T1細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化傳代。RAW細(xì)胞用細(xì)胞刮刀刮下。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動物實(shí)驗(yàn)：將1×106個4T1細(xì)胞注射進(jìn)21只雌性小鼠(n=3)第4對乳腺，在接種后的不同時間點(diǎn)(分別是第5、10、15、20、25 和第30天)處死小鼠，取腫瘤組織后稱量，按照質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入PBS進(jìn)行勻漿，2 000r/min 離心,15 min，取上清，按照測量乳酸試劑盒的方法測其乳酸濃度。

1.3.2 PCR：將RAW細(xì)胞以1×106個/孔接種于6孔板中，隔夜換液，用不同濃度的乳酸處理細(xì)胞，24 h后按Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度，并稀釋至工作液濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。RT-PCR反應(yīng)根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。Real-time PCR根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。RT-PCR引物序列：NFκB P50正向：5′-GCCAAAGAAGGACACGAC-3′，反向5′-ATCAC CCTCCAGAAGCAG-3′；NFκB P65正向：5′-CTGATG GAGTACCCTGAAGC-3′，反向：5′-TCCGCAATGGAG GAGAAG-3′。Real-time PCR引物序列：CD206正向：5′-GCAAGTGATTTGGAGGCT-3′，反向:5′-ATAGGAA ACGGGAGAACC-3′；Arg1正向：5′-GCAAGACAGCA GAGGAGGTG-3′，反向：5′-GCAGTCAGTCCCTGGCTT AT-3′；NOS2正向：5′-GAGCGAGTTGTGGATTGTC-3，反向：5′-CCAGGAAGTAGGTGAGGG-3′。

1.3.3 Western blot：將RAW細(xì)胞以1×106個/孔接種于6孔板中，乳酸處理24 h后提取細(xì)胞總蛋白，行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜。3%牛血清白蛋白封閉1 h。一抗1∶500(CD206、Arg1或NOS2)或1∶1 000(β-actin)稀釋，4 ℃搖床過夜。TBST洗膜10 min，3次。二抗1∶5 000稀釋,室溫孵育1 h，TBST洗膜同前。加入化學(xué)發(fā)光液，5 min后暗室顯影。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)：用細(xì)胞刮刀將RAW細(xì)胞刮下，PBS洗1遍后計數(shù)，取5×105個細(xì)胞，用100 μL含0.5 μL熒光標(biāo)記抗體anti-CD206-Fluor488的染色緩沖液重懸，室溫暗處染色20 min，加入500 μL PBS洗兩遍， 400×g離心, 4 min。200 μL PBS重懸后行流式細(xì)胞儀分析計數(shù)(Merck Millipore公司)。

1.3.5 蛋白芯片:按照說明，將芯片用封閉液封閉1 h，同時孵育樣品和抗體混合物1 h。將孵育好的樣品加入芯片上，4 ℃搖床過夜。用洗膜緩沖液洗芯片10 min，洗3遍。加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床30 min后洗3次，加入發(fā)光底物后顯影。

1.3.6 吞噬實(shí)驗(yàn)：6孔板中的RAW細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入γ-干擾素和LPS作用4 h，然后加入FITC標(biāo)記的BSA，每孔5 μL，分為37 ℃和4 ℃兩組，4 ℃作為對照組。3 h后取出細(xì)胞， 400×g離心,4 min，用500 μL PBS洗兩遍，200 μL PBS重懸行流式細(xì)胞儀分析計數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠乳腺腫瘤組織的乳酸濃度升高

Balb/C小鼠正常乳腺組織乳酸濃度為(9.2±1.3)μmol/g，接種4T1乳腺癌細(xì)胞后第5天腫瘤組織乳酸濃度升至(25.4±3.7)μmol/g(Plt;0.01)，第25天升至(32.9±1.8)μmol/g(Plt;0.01)。

2.2乳酸上調(diào)RAW細(xì)胞M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子的表達(dá)

15 mmol/L乳酸處理RAW細(xì)胞 24 h后，如圖1A、1B和1D所示， M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子甘露糖受體CD206和精氨酸酶Arg1升高， M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子一氧化氮合酶(NOS2)降低。RAW細(xì)胞CD206陽性群體增多(圖1C)(Plt;0.05)。

A.RT-PCR；B.Western blot； C.FACS；D.real-time PCR;*Plt;0.05 compared with untreated control(NC)圖1 15 mmol/L乳酸上調(diào)RAW細(xì)胞的M2 標(biāo)志分子CD206和Arg1,下調(diào)M1標(biāo)志分子 NOS2

2.3乳酸減少RAW細(xì)胞分泌的M1型巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子

細(xì)胞因子蛋白芯片結(jié)果(圖2A和2B)顯示，15 mmol/L乳酸處理RAW細(xì)胞24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子譜發(fā)生改變，M1型細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-1α減少，趨化因子如CCL2、CCL5等也減少(Plt;0.05)。

2.4乳酸對RAW細(xì)胞吞噬功能沒有影響但降低其抗原遞呈功能

15 mmol/L乳酸處理24 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測RAW細(xì)胞吞噬功能(圖3A)和抗原遞呈功能的影響(圖3B)。吞噬功能無明顯變化，MHC Ⅰ、MHC Ⅱ分子和協(xié)同刺激分子CD80表達(dá)減少(Plt;0.05)。

2.5 NFκB參與乳酸對RAW細(xì)胞的調(diào)控

15 mmol/L乳酸處理后，RAW細(xì)胞NFκB P50蛋白水平(圖4A)和RNA水平(圖4B)都有升高(Plt;0.05)。NFκB P65蛋白表達(dá)水平升高(Plt;0.05)，其磷酸化水平降低(Plt;0.05)(圖4A)。

3 討論

乳酸作為腫瘤細(xì)胞有氧糖酵解的產(chǎn)物，其大量堆積是腫瘤微環(huán)境的重要特點(diǎn)[7]。在本研究中，對小鼠接種乳腺癌細(xì)胞系后測量其腫瘤組織內(nèi)乳酸濃度，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織的乳酸濃度明顯高于正常乳腺組織，在體內(nèi)說明乳酸大量存在于腫瘤組織中。

巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)分為兩種類型。Th1型細(xì)胞因子或病原體使巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M1型，表現(xiàn)為高表達(dá)MHC Ⅱ，產(chǎn)生大量TNFα、IL12和NO，可殺死病原體和靶細(xì)胞。Th2型細(xì)胞因子使巨噬細(xì)胞M2型激活，表現(xiàn)為CD206和Arg1表達(dá)增高，具有促進(jìn)血管新生和組織修復(fù)等功能[8]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages,TAMs)大多為M2型，TAMs的基因表達(dá)譜分析表明其確實(shí)向M2型偏移[9]，并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和血管新生[10]。本實(shí)驗(yàn)中乳酸處理后RAW細(xì)胞的CD206、Arg1等M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志分子升高，M1型標(biāo)志分子 NOS2降低。細(xì)胞因子蛋白芯片結(jié)果表明，乳酸處理后RAW細(xì)胞表達(dá)的M1型細(xì)胞因子TNFα、IL1、γ-IFN等明顯減少。說明乳酸對巨噬細(xì)胞向M2型極化具有促進(jìn)作用，同時抑制M1型細(xì)胞因子分泌。

抗原遞呈是引發(fā)機(jī)體適應(yīng)性免疫的一個重要步驟。乳酸降低RAW細(xì)胞MHCI和MHCⅡ分子的表達(dá)，說明乳酸削弱了巨噬細(xì)胞的抗原遞呈能力，這反映了乳酸的存在不利于抗腫瘤免疫的發(fā)生和擴(kuò)大，同時也是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的一個重要因素。另研究表明MHC ⅡlowTAMs能夠促進(jìn)小鼠腫瘤的進(jìn)展，抑制T細(xì)胞激活，分泌免疫抑制性因子[11]。

A.cytokine array scanning image；B.mean Pixel density assay; *Plt;0.05,**Plt;0.01 compared with untreated control(NC)

A.FACS；B.FACS; *Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with untreated control(NC)圖3 乳酸對RAW細(xì)胞吞噬功能沒有影響但是減弱其抗原遞呈功能Fig 3 Lactic acid had no effect on phagocytosis but decreased antigen presenting function of RAW cells

A.Western blot；B.RT-PCR; *Plt;0.05 compared with untreated control(NC)圖4 NFκB參與乳酸對RAW細(xì)胞的調(diào)控Fig 4 NFκB contributed to lactic acid regulation of RAW cells

本研究發(fā)現(xiàn)乳酸處理后，RAW細(xì)胞的NFκB P65磷酸化水平降低，說明NFκB活性降低參與調(diào)控乳酸促進(jìn)RAW細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化的作用，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究表明小鼠乳腺癌組織中的乳酸濃度升高，乳酸使RAW細(xì)胞表現(xiàn)為M2型，M1型細(xì)胞因子分泌減少，抗原遞呈功能減弱，NFκB在這個過程中發(fā)揮一定作用，具體機(jī)制有待研究。

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Lactic acid regulates phenotypepolarization and function of macrophages in tumor microenvironment

LIU Yan, CHEN Chong, CAO Feng-qi, BAI Li-peng, LUO Yun-ping*

(Dept. of Immunology,Institute of Basic Sciences,CAMS,School of Basic Medicine,Peking Union Medical College, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo investigate that lactic acid regulates polarization of phenotype and function of macrophages in tumor microenvironment.MethodsBalb/c mice were inoculated by 4T1 breast tumor cells with the mammary gland injection.The tumor tissues were harvested at different time points and detected the lactic acid concentration. The expression of M1 and M2 markers in RAW264.7 cells treated with different concentration of lactic acid were detected by RT-PCR,FACS and Western blot. The mouse cytokine array chip was used to evaluate the release of cytokines from RAW cells treated with 15 mmol/L lactic acid. Phagocytosis and antigen presenting function was evaluated by using FACS.Resultslactic acid concentration of mouse breast tumor was higher than that of normal breast tissue(Plt;0.05). M2 markers of RAW cells were up-regulated and M1 markers were down-regulated by 15 mmol/L lactic acid(Plt;0.05).M1 cytokines secretion of RAW cells treated with 15mmol/L lactic acid was down-regulated(Plt;0.05). Phosphorylated NFκB P65 was down-regulated by 15mmol/L lactic acid(Plt;0.05).The phagocytosis was not affected by lactic acid, but the expression of the antigen presenting and co-stimulatory molecules were down-regulated in RAW cells treated with 15 mmol/L lactic acid(Plt;0.05).Conclusionslactic acid induces the M2 phenotype shift and inhibits the antigen presenting function of RAW cells. NFκB P50/P65 are involved in the phenotype polarization of macrophages.This study suggested that lactic acid plays an indispensable role in macrophages polarization in tumor microenvironment.

tumor microenvironment; breast tumor; lactic acid; macrophages

2014- 02- 17

2014- 04- 12

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2013CB967202)

*通信作者(correspondingauthor)：Yunpingluo@hotmail.com

1001-6325(2014)06-0740-06

R 392.1

A