應用組織特異性分子的保守序列鑒定人源細胞的組織來源

孫 昊，劉玉琴，卞曉翠，楊振麗，趙曉梅

（中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院病理學系細胞資源中心，北京 100005）

體外培養(yǎng)的實驗細胞資源是目前醫(yī)學與生命科學領域應用最廣泛、最重要的實驗工具之一，使用背景清楚的細胞是實驗可靠的關鍵。尤其是人類細胞用于發(fā)病機制研究及藥物研發(fā)，要求往往更為嚴格。被交叉污染細胞的使用，雖然很早已被認識，但近年來隨著實驗細胞的更廣泛應用，其擴大的趨勢與實驗要求的提高形成了巨大反差。本實驗室早先已對于實驗細胞的種屬鑒定［1］和細菌、支原體污染鑒定做了深入研究，STR檢測分析用于識別人類細胞的個體起源。本實驗建立同一個體不同組織起源的鑒定新方法。眾所周知，細胞可以通過形態(tài)和生長狀態(tài)對細胞的組織來源進行初步分析，但要準確分析，很多實驗室和保藏中心往往采用抗原抗體爬片、Western blot和基因芯片大通量測序等方法，其比較耗時耗力，成本也高，且常常參比標準不明顯，易受外在條件干擾。本研究通過反轉(zhuǎn)錄PCR對17個分子進行組織特異性驗證，篩選出可用于鑒定常見細胞組織起源的指標，并對部分庫藏細胞進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

本實驗中所有細胞及培養(yǎng)基都由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心提供（表1），所有細胞的培養(yǎng)方法按常規(guī)進行。

1.2 哺乳動物細胞mRNA的提取純化和cDNA的合成

應用Trizol（Takara公司）試劑進行細胞mRNA的提取，氯仿/無水乙醇純化，操作步驟按試劑盒說明書進行。對提純的mRNA紫外分光光度儀（Ⅵ trospec 2100 pm）上讀取 A260、A280和 A230以檢測mRNA的濃度及純度;應用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司）PCR合成cDNA，cDNA經(jīng)紫外分光光度儀（Ⅵtrospec 2100 pm）上讀取 A260、A280和 A230以檢測cDNA的濃度及純度。以100 ng cDNA為模板，以人類和小鼠通用GAPDH引物（GAPDH-F:5-GGTGA AGGTCGGAGTCAACG-3;GAPDH-R:5-GGCAGTGA TGGCATGGACTG-3）于55℃退火進行PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA。

表1 研究中實驗組和驗證組所使用細胞Table 1 List of cell lines of training and test group

1.3 組織特異性引物的選擇及合成

根據(jù)文獻報道及NCBI數(shù)據(jù)庫中信息，選取17種細胞組織特異性的組織因子，并根據(jù)這些特異組織因子mRNA的結(jié)構和保守序列設計針對的引物（表2），引物由Invitrogen公司合成。

1.4 引物特異性的篩選

以50～100 ng已知細胞cDNA為模板，與上述17對組織特異性引物以最適退火溫度進行PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，結(jié)合文獻報道，判斷引物是否可對特定組織來源cDNA進行特異性擴增。條帶的位置及分子質(zhì)量符合預期為陽性對照;以無菌水為陰性對照。

1.5 引物敏感性的檢測

以篩選出的9對引物和對應細胞cDNA進行PCR擴增。選擇有代表性細胞cDNA為底物。細胞 cDNA 分別取 100、50、25、10、1、0.1、0.01 和0.001 ng作為模板進行PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶以判斷引物的敏感性。

1.6 聚合酶鏈式反應

引物特異性篩選和引物敏感性檢驗:冰上混合20 μL反應體系（Takara公司），于PCR反應儀（G-STORM）上進行擴增，95℃預變性5 min，95℃30 s，以摸索出的各引物最適溫度退火30 s，72℃1 min，32個循環(huán)后72℃再延伸10 min。通過向反應體系中加入MgCl2，使退火溫度統(tǒng)一在61℃左右，便于在雙盲條件下對檢測細胞組織來源新方法進行驗證。

表2 人類細胞組織鑒定的特異性引物序列Table 2 Sequences of human tissue specific primers

1.7 雙盲法檢測未知細胞組織來源

細胞培養(yǎng)及mRNA提取、RT-PCR由不同人員完成。細胞培養(yǎng)者收集細胞，進行樣品編號。提取mRNA由專人完成。僅以帶數(shù)字編號的mRNA給予后繼實驗者。后繼實驗人員反轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA，以50～100 ng待檢測細胞 cDNA為模板，將上述初選得到的17對組織特異性引物，以95℃預變性5 min，95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)后72℃再延伸10 min，進行PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，參照上述篩選引物擴增出的條帶，判斷該編號細胞的組織來源。與進行編號的工作人員比對樣品信息，驗證新方法是否有效、準確。

2 結(jié)果

2.1 提取細胞mRNA及合成cDNA的質(zhì)量檢測

提取的哺乳動物細胞mRNA A260/A280在1.8～2.0之間（提示蛋白含量低）。反轉(zhuǎn)錄cDNA以GAPDH引物擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳條帶均一、致密、分子質(zhì)量在540 bp（圖1）的為合格樣品。對于降解的樣品，重新培養(yǎng)細胞，重新提取mRNA。

2.2 引物特異性的篩選

擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果（圖2）。由此可見，其中 ALB、AFP、LCA和CHD16的4對引物只能從與其相應組織來源的細胞cDNA中擴增出目標分子質(zhì)量的條帶，無其他雜帶，說明這4對引物有較好的組織特異性。但是針對 SFPDH、FLT、MUL2和SYN的引物除有目的條帶（285、173、264和128 bp）外，還有背景條帶，但是這些背景條帶的分子質(zhì)量與目標條帶的大小相差較遠，不影響結(jié)果判斷。另外還需要說明的是，經(jīng)多次實驗，針對PSA蛋白mRNA保守區(qū)域設計的引物可廣泛在人類內(nèi)皮、上皮來源細胞中擴增出明顯條帶（小鼠細胞除外），不具組織特異性。其原因可能是該引物擴增mRNA序列在人類細胞中廣泛表達或可能具有種屬特異性，有待進一步研究。經(jīng)特異性和敏感性檢測后篩選得的9對引物（表3）。

2.3 引物敏感性的檢測

9對引物在10 ng cDNA模板時都能得到清晰可見的條帶;有的引物如ALB甚至在模板量低至0.01 ng時仍可以看到較清晰的條帶;9對引物中敏感性較差的引物如 MUL2、FLT和 PSA等在1 ng cDNA時也可以看到較弱的條帶（圖3）。

圖1 細胞cDNA內(nèi)參GAPDH擴增結(jié)果Fig 1 PCR amplification with GAPDH primers and cDNA

表3 人類組織來源、組織特異因子、PCR結(jié)果對應關系Table 3 Tissue specific indicators of human cells by RT-PCR

圖2 RT-PCR擴增的組織特異性檢測電泳圖Fig 2 Tissue specificity of the RT-PCR amplification analyzed by 2%agarose gel electrophoresis

2.4 應用篩選出的8個組織細胞特異因子鑒定培養(yǎng)細胞的起源

對編號樣品的檢測結(jié)果（圖4），與培養(yǎng)細胞的編號人員比對，10個編號細胞經(jīng)由此方法所判斷的組織來源與初始信息相吻合。表明此法對鑒定細胞組織來源有效。

圖3 種屬特異性引物PCR擴增的敏感性檢測Fig 3 Sensitivity of RT-PCR amplification analyzed by 2%agarose gel electrophoresis with corresponding primers

3 討論

交叉污染或錯誤鑒定細胞的使用越來越廣泛，已嚴重影響了科研質(zhì)量，必須停止使用。細胞存在交叉污染占細胞資源的17% ～35%，其中一大部分是同物種乃至同個體不同組織來源細胞的混雜。對于細胞組織來源的檢測手段包括細胞形態(tài)分析、Western blot、免疫組化和基因芯片測序等方法。這幾種方法比較粗糙或繁瑣、耗時耗力，成本高昂，所以本論文研究通過篩選驗證組織特異性因子表達，建立RT-PCR法鑒定細胞的組織來源的方法。

根據(jù)文獻選擇了17個組織細胞特異因子。依據(jù)如下:血清白蛋白（ALB）基因轉(zhuǎn)錄有較高的水平，CCAAT盒、TATA盒以及HNF1為ALB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，驅(qū)動該基因在肝臟特異性表達［9］。甲胎蛋白（AFP）不存在于健康成人組織，其主要在異常功能的肝細胞中合成，在成人中具有組織特異性［6］。酪氨酸激酶受體（Flt-1）是血管內(nèi)皮生長因子之一，F(xiàn)LT-1特異性地表達于內(nèi)皮細胞和上調(diào)的腫瘤脈管系統(tǒng)［4］。囊泡錨定蛋白（synapsin）是一種存在于大小突觸囊泡的神經(jīng)元特異性磷酸化蛋白。非神經(jīng)元細胞廣泛表達NRSF/REST蛋白，其抑制Synapsin在非神經(jīng)元細胞中的表達［8］。表面活性蛋白家族（SFTPA、B、C和D）是肺發(fā)揮正常表面活性劑功能和激素調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，SFTPB選擇特異性地表達于肺細支氣管和肺泡上皮細胞［10］。LCA（CD45）也稱為白細胞共同抗原，由所有造血細胞除紅細胞和血小板完全表達，在T淋巴細胞經(jīng)抗原刺激的細胞增殖和胸腺發(fā)育起關鍵作用［11］。鈣黏蛋白（CDH16）為膜結(jié)合糖蛋白員，在腎系統(tǒng)中特異性表達［2］。黏蛋白（MUL）是一類高分子量高度糖基化蛋白，在動物上皮組織細胞中產(chǎn)生，具有細胞信號傳導、化學屏障功能［3］。

圖4 9個編號細胞的RT-PCR檢測預判電泳與初始信息比對Fig 4 Gel electrophoresis of the PCR products from unknown 9 number cells compares with initial information

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中信息，設計17對引物，分別對應前述16種編碼組織特異性因子的mRNA保守序列，并檢測分析其組織特異性。使用背景明確的已知細胞的mRNA，經(jīng)RT-PCR反應，檢測分析判斷其特異性和敏感性。確定其中8對引物，這8對引物有較好的特異性和敏感性，特異性因子ALB、AFP、SYN、CDH16、SFTPB、LCA、FLT 和 MUL2 的對應引物可有效應用于鑒定細胞是否源自肝、腎、神經(jīng)、肺、造血、內(nèi)皮和分泌組織;特異性因子PSA對應引物在人類各組織細胞均擴增出條帶，但小鼠細胞中未見擴增帶。經(jīng)雙盲法，利用編號的未知起源的細胞 mRNA，進行細胞起源的鑒定，可以鑒定HEPG2、SKNSH、A549、A498、K562、THP 等諸多細胞的組織起源。

以上結(jié)果證實，這種RT-PCR方法敏感、特異，而且價格低廉，能快速地鑒定實驗人類細胞的組織來源，應用于未知細胞的組織來源和已知細胞是否出現(xiàn)種內(nèi)組織交叉污染的初篩。但是，本研究只選得了7種組織鑒定的特異引物，對其他組織鑒定可用的特性因子的PCR檢測體系還有待繼續(xù)完善，操作方法有待進一步簡化提高。另外，隨著保藏細胞的增加，仍需要擴大檢測的范圍。

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