小分子干擾RNA非病毒納米載體的設計進展

鄭榮

上海市普陀區婦嬰保健院，上海 200062

將與內源性m RNA序列相對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(doub lestranded RNA，dsRNA)導入細胞，可使內源性m RNA降解和基因沉默，這種轉錄后的基因沉默機制稱為RNA干擾(RNA interference，RNA i)[1]。小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)是一類長約21-23個核苷酸單位的dsRNA分子，是RNA i發揮作用的中間效應分子，它可以是內源性的或外源性的[2]。雖然RNA i技術可在哺乳動物體外培養的細胞中廣泛應用，但其在體內的應用還是很有限的[3]。這主要是由于siRNA的核酸本質所致：(1)由于血漿中核酸酶的存在，siRNA的半衰期不到15m in[4]；(2)siRNA的本質為核酸，其負電性與極性導致其很難穿過脂質雙分子層的細胞膜，裸露的siRNA在體內不能快速透過血管內皮、滯留于脾臟等血液儲存場所、易于被腎小球濾過、以及被細胞內的核酸酶降解[5]；(3)siRNA的脫靶效應[6]；(4)siRNA的免疫原性刺激[7,8]。隨著RNA i在研究基因功能、治療遺傳相關疾病以及抗癌藥物方面的快速發展，siRNA的體內運送成為備受關注的問題。因此，要將siRNA分子成功導入生物體并發揮有效的治療作用，首先應解決載體問題。由于生物體內直接應用siRNA分子的限制，大多數研究都借助于給藥載體：包括病毒載體和非病毒載體兩類。盡管病毒載體給藥系統在體外的轉染效率很理想，但是其有潛在的細胞毒性、免疫原性以及炎癥反應使得其應用受到很大的限制[9]。非病毒載體包括多種載體方式給藥，納米粒載體是由生物材料制備的非病毒載體，粒徑大小在 1～1000 nm。納米粒在遞送siRNA方面具有很多優點，比如提高siRNA在體內的穩定性，具有靶向功能，降低細胞毒性和免疫原性，增加細胞攝取和內化行為等，這些都有利于提高siRNA的基因沉默效率。此外，通過對已形成納米粒遞送系統的修飾，可進一步提高納米粒在體內遞送的穩定性，增加細胞的靶向功能以及促進siRNA在細胞質的釋放等。非病毒納米載體材料主要包括：聚合物材料、脂質材料和蛋白多肽類材料[10]。現分別就各類材料中的具體載體物質的結構和生物學特征作如下介紹。

1 高分子聚合物材料介導的siRNA給藥系統

由于siRNA荷負電，荷正電的陽離子聚合物可以與之以靜電結合力相組裝，從而完成siRNA的包載。聚合物載體材料又可分為合成高分子聚合物與天然高分子聚合物。

1.1 合成高分子聚合物 該類化合物主要包括聚乙烯亞胺(polyethylenim ine，PEI)及其修飾物、聚丙交酯乙交酯(polylactide-co-glycolide，PLGA)、以及聚酰胺-胺型樹枝狀高分子(polyam idoam ine dendrimei，PAMAM)。

PEI及其修飾物分為分枝狀和線狀兩種類型，相對分子質量為1×103至1×106，分枝狀的轉染效率優于線狀[11]。PEI作為siRNA轉染載體的機制為：PEI分子中大量的質子化氨基基團可以與 siRNA 形成非共價的高電解質分子復合物，被細胞內吞后，通過獨特的“質子海綿效應”，增強質子和水的內流，導致細胞內涵體破裂釋放出 siRNA 到胞漿[12,13]。但是PEI因其較高的分子量和較大的使用劑量而具有一定的毒性，通過對PEI結構的修飾來達到保持基因遞送效率和降低毒性的平衡是目前研究的熱點。通過偶聯親水性基團到PEI的結構上是一種解決PEI毒性問題的可行方法。但是耦合親水性基團之后仍要能保持PEI一定的正電荷密度以達到穩定結合siRNA的能力。Oskuee 等人通過對PEI的羧基化來提高它的親水性和中和PEI表面的一部分正電荷，修飾之后的PEI在沒有降低它的“質子海綿”效應的前提下減少了毒性，提高了基因沉默效率[14]。Schiffelers等人將RGD環狀三肽作為靶頭修飾到PEG化的PEI表面，制備了靶向siRNA轉染系統。結果表明該載體的靶向性能提高了，并且粒子半徑減小至70～100 nm，穩定性增加[15]。

PLGA是乳酸和乙醇酸通過酯鍵連接的共聚物，在體內代謝的最終產物為二氧化碳和水，是一類無毒、生物可降解、生物相容性好的高分子材料。其包裹的siRNA被釋放到細胞之中。執行相應的功能。研究表明影響PLGA納米粒載體介導基因轉染的因素主要有溶液pH、納米粒與siRNA的比例等[16]。采用噴霧干燥技術制備的PLGA納米球作為siRNA載體，可減小聚集并提高轉染率[17]。近年來PLGA的修飾物大有發展。使用聚乙二醇-PLGA作為載體進行siRNA的體外運送試驗結果顯示：聚乙二醇化的PLGA載體材料可以增加其轉染效率[18]。

樹枝狀大分子是有規律地高分散性排列的結構大分子，而且其結構形狀、分子量大小和表面所帶電荷均可以調整。這些特殊的結構使得樹枝狀大分子能夠通過內部封裝、表面吸附和化學偶聯來裝載藥物。PAMAM近年來已經被廣泛應用于基因藥物治療的載體研究。但在siRNA遞送方面的研究還具有很大的潛力。PAM AM的化學結構表面上有伯胺基，內部有叔胺基。伯胺基可以與核酸分子結合，有效壓縮核酸分子的粒徑在納米級范圍內以促進細胞的攝取。而叔胺基則可以在核內體中引起“質子海綿”效應，從而促進核酸分子從核內體中的逃逸和在細胞質中的釋放。

此外，樹枝狀高分子聚合物聚丙酰胺在遞送siRNA方面也有研究，但是相對較少。Taratula研究發現，聚丙酰胺的代數越高，在與siRNA形成離散型納米粒的程度就越好。但是隨著代數的增加，粒徑和表面電荷也隨之增加，聚丙酰胺的毒性也不斷增加[19]。

1.2 天然高分子聚合物 該類化合物由于其廣泛的來源性以及良好的生物相容性，在siRNA傳遞方面備受關注。主要包括：殼聚糖、環糊精以及膠原蛋白。

殼聚糖是由殼多糖去乙酰化衍生而來的一類天然高分子多糖，主要存在甲殼動物和昆蟲殼上。殼聚糖因其具有低毒性、低免疫原性以及出色的生物降解性和生物相容性等優點，已成為構成siRNA遞送載體的常用材料。帶正電荷的殼聚糖能夠通過電荷作用力與帶負電的DNA和siRNA絡合形成基因遞送系統。

為了提高殼聚糖載體遞送s i R N A的效率，Opanasopit將殼聚糖分別與谷氨酸、醋酸和鹽酸反應生成殼聚糖鹽，然后再與siRNA通過靜電相互作用形成遞送系統。實驗結果發現，影響殼聚糖/siRNA復合物形成的主要因素是殼聚糖的分子量以及殼聚糖與酸二者之間的質量比。低的殼聚糖分子量(20 kDa)和高的質量比形成的殼聚糖/siRNA具有高的基因沉默效率。他們還利用羥基苯并三唑與殼聚糖成鹽后與siRNA結合形成復合物，在殼聚糖分子量為20 kDa，質量比高達80時，基因沉默效率能達到60%[20]。利用硫胺素焦磷酸的磷酸基團與殼聚糖上的氨基反應成鹽后不但可以提高殼聚糖本身的水溶性，硫胺素焦磷酸上的氨基具有優越的“質子海綿”效應，這些性質可以大大提高siRNA在體內的基因沉默效率[21]。有研究顯示：利用維生素E的琥珀酸鹽與不同分子量的寡聚殼聚糖進行偶聯得到兩親性的α-生育酚-寡聚殼聚糖。實驗結果表明，在寡聚殼聚糖的分子量為4 kDa時得到的siRNA遞送載體能夠顯著提高siRNA的細胞攝取(＞98%)和沉默效率[22]。另有文獻表明，經過RGD修飾的殼聚糖/siRNA遞送系統能夠高效和有選擇地輸送到腫瘤細胞[23]。

環糊精具有外緣親水而內腔疏水的獨特的幾何結構特征，因而在包載疏水性藥物方面具有明顯的優勢。盡管在遞送質粒DNA有較多的研究，但是有關用它遞送siRNA的研究并不多。Dav is研究合成了一種新型遞送系統-環糊精聚合物，利用聚合物所帶的正電荷與siRNA通過電荷相互作用自組裝形成納米粒，能成功地將siRNA遞送到靶細胞中[24]。實驗結果表明，利用這種新型的基因遞送載體遞送siRNA能夠顯著抑制小鼠轉移尤文氏肉瘤的生長速度。

膠原蛋白是一類天然高分子物質，具有生物可降解以及良好的生物相容性， Takeshita等人通過將等體積的膠原蛋白與siRNA溶液相混合，制備了一種siRNA/膠原蛋白復合物[25]，體外試驗測定其具有長循環特性和癌組織蓄積性，并且無免疫原性。但是相關研究還是比較少的。

2 脂質材料介導的siRNA輸送系統

脂質體是由磷脂、膽固醇等膜材包合而成，具有類似生物膜結構的雙分子層囊泡。用于包載siRNA的主要為中性脂質體與陽離子脂質體。中性脂質體可用于體外siRNA的遞送。其脂質材料包括：二油酰磷脂酰膽堿等。但是中性脂質材料由于其結構特點，并不常單獨用于siRNA的遞送，而是較多地與陽離子脂質體聯合應用。用于siRNA遞送的脂質體多為陽離子脂質體，常用的陽離子磷脂有1，2-二油酰基-3-三甲基氨基內烷、N-[1-(2，3-二油酰)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨、二油酰基磷脂酰乙醇胺、膽固醇等。M o rrissey采用陽離子脂質、致融類脂和聚乙二醇化的磷脂形成磷脂雙分子層，把兩種siRNA分子，HBV263和HBV1583，依靠電荷相互作用包載進水溶性中心之后，形成了一種穩定的脂質體。它不僅可以促進細胞攝取和核內體逃逸，而且大大增加在體內循環系統的時間，提高了siRNA對肝炎病毒的干擾作用[26]。但是，由于陽離子脂質材料的細胞毒作用，其應用還是很有限。但是隨著材料的不斷進步，二油酰基磷脂酰乙醇胺等已經比1，2-二油酰基-3-三甲基氨基內烷的毒性小了很多，可用于體內外的試驗當中。

3 多肽類介導的siRNA遞送系統

因為多肽的低毒性，常常用來作為核酸的運送載體材料。但是，相對于其他陽離子材料來說，它不能有效地壓縮核酸以及在細胞質中釋放核酸，因此在用作核酸的載體材料時研究人員會選擇性對其加以修飾。聚天冬氨酸二乙基色胺(聚天冬氨酸的一種衍生物)具有PH敏感的裂解核內體作用[27]。它能裂解細胞膜可能是因為在核內體的PH條件下，它分子中的1,2-二氨基乙烷能形成雙質子，從而具有“質子海綿”效應。因此可以在不引起細胞毒性的情況下，高效的對核酸進行轉染。

4 新材料的構想設計

基于上述幾類siRNA的非病毒納米載體的介紹，不難發現其中各有優劣，因此將其聯合應用或者進行新材料設計是勢在必行的。根據siRNA荷負電以及易于被核酸酶水解的特性，制備成納米材料將其包被在內部可以增加其穩定性。Yelena Vachutinsky等人曾設計了一種聚合物膠束用于靶向新生血管的質粒DNA的傳遞[28]，在其基礎上構想了一種新的siRNA的載體材料。將聚乙二醇與巰基化的殼聚糖形成嵌段共聚體，經過二硫鍵的固化交聯形成嵌段共聚物納米粒，其中聚乙二醇為親水性，位于膠束外側，而殼聚糖部分含有多個荷正電氨基，位于膠束內核處，并與siRNA通過靜電結合作用結合，將其包裹于內部。現以靶向腫瘤新生血管的siRNA的遞送系統為例加以說明。

RGD為整合素受體αv家族的一個識別模塊，將其修飾于該聚合物膠束外側，可完成對新生血管的靶向作用[29,30]。參考Yelena Vachutinsky等人制備二硫鍵交聯的嵌段共聚物膠束，二硫鍵的作用可以提高該膠束在細胞外的穩定性，故將殼聚糖巰基化，并與聚乙二醇相接構成嵌段共聚物。經固化交聯作用形成穩定的膠束。由于聚乙二醇與殼聚糖具有良好的生物相容性與生物可降解性，而RGD具有良好的新生血管靶向性，推測該結構將會成為一個比較理想的siRNA的傳遞系統。

5 小結與展望

從發現雙鏈RNA在線蟲體內可以干擾特定基因的表達，RNA干擾現象就引起了全球關注，siRNA作為疾病治療藥物的前景逐漸被醫藥學工作者認識。為了有效遞送siRNA到內體發揮基因沉默效應，種類多樣的非病毒載體的研究得到了快速發展。但是要使siRNA治療在臨床上得到成功應用，siRNA的遞送仍然是橫亙在實驗室研究與臨床應用之間的壁壘。因此，研究和開發安全有效的遞送材料和遞送系統將是基因治療研究的熱點。

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