微生物多糖對巨噬細胞的激活作用及其機制＊

李 晶 錢 文 陳靠山，2 王國棟

1 皖南醫(yī)學院藥學院，安徽省多糖藥物工程技術研究中心，安徽蕪湖 241002； 2 山東大學生命科學學院，國家糖工程技術研究中心

巨噬細胞起源于血單核細胞，是一類古老而又系統(tǒng)發(fā)育保守的免疫細胞，它和中性粒細胞一起組成了上皮屏障后宿主防御的第一道防線，在非特異性免疫應答中發(fā)揮著重要的作用，此外巨噬細胞還可以作為抗原遞呈細胞與T淋巴細胞相互作用來調節(jié)適應性免疫應答［1］。許多生物活性物質都可以激活處于靜息狀態(tài)的巨噬細胞，被激活的巨噬細胞可以產生和分泌多種細胞信號分子和細胞因子，發(fā)揮其免疫調節(jié)、抗腫瘤、促炎或抗炎、趨化等作用［2］。此外，巨噬細胞還在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復、清除凋亡細胞和造血的組織重構過程中扮演了重要的角色［3，4］。

糖類是構成生命的三大基本物質之一，而多糖是一類由10個以上單糖通過糖苷鍵鏈接而成的大分子物質，除了具有重要的生理意義外，部分多糖還具有良好的藥理學活性，例如免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗炎癥、抗病毒及抗氧化等功能［2］。其中免疫調節(jié)是多糖最重要的藥理學活性之一，由于巨噬細胞是機體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，并且在一定程度上能夠影響機體的適應性免疫，因此能夠增強巨噬細胞功能就可以理解為能夠增強機體的免疫力［1］。經研究發(fā)現，許多從植物、動物、微生物中得到的多糖都能激活巨噬細胞，繼而增強機體的免疫功能［5］。在這些不同來源的生物活性多糖中，微生物多糖由于其生產周期短，不受季節(jié)、氣溫等條件限制，且產量高、純化簡單，所以具有較強的市場競爭力和廣闊的發(fā)展前景，因此本文總結了近年來新發(fā)現的微生物多糖對巨噬細胞的免疫調節(jié)作用及其分子機制，旨在為微生物多糖資源的開發(fā)和利用提供一定的參考。

1 微生物多糖對巨噬細胞功能的影響

1.1 對NO生成的影響 NO是一種重要的細胞信號分子，廣泛參與了機體多種生理和病理過程，也是一種毒性分子，對腫瘤細胞和病原微生物有很強的殺傷作用［6］。在巨噬細胞中是由誘導型一氧化氮合酶（iNOS）催化L－精氨酸轉變?yōu)長－瓜氨酸而產生［7］。許多微生物來源的多糖都可以誘導巨噬細胞產生NO。Chang ZQ等從一種多黏類芽孢桿菌JB115的發(fā)酵液中分離純化獲得一種β－葡聚糖，能夠在30～300μg／ml范圍內劑量依賴性的誘導RAW264.7小鼠巨噬細胞產生 NO，在300μg／ml的劑量作用下，所產生的NO濃度是陰性對照的10倍［8］。Xiao JF等從一種海洋絲狀真菌YS4108的菌絲體中分離純化獲得一種α－葡聚糖YCP，也能夠在50～250μg／ml劑量依賴性的誘導 RAW264.7細胞產生NO［9］。而一種從香菇子實體中獲得的β－葡聚糖，可以激活核轉錄因子NF－κB，但卻不能誘導RAW264.7細胞表達iNOS和產生NO，這可能與該多糖刺激NF－κB的P65亞基與另一未知亞基形成復合物，而無法啟動相關炎癥基因的轉錄有關［10］。

1.2 對細胞因子分泌的影響 巨噬細胞可以被選擇性激活，分別極化成為M1（Classically activated macrophage）或 者 M2 （Alternatively activated macrophage），M1細胞呈現出促炎癥反應的能力，維持Th1適應性應答，能夠分泌促炎癥細胞因子如IL－1、IL－6、IL－12、TNF－α，并對病原微生物或者癌細胞表現出較高的吞噬能力。而M2細胞呈現出抗炎癥活性。抑制Th1應答，促進Th2應答，能夠分泌抗炎癥細胞因子（IL－10、TGF－β），產生 Th2細胞化學引誘物［11］。目前文獻所報道微生物來源的多糖多為能夠促進巨噬細胞M1極化。Se Eun Byeon等從松茸中分離純化得到一種多糖片段TmC－2，可以在（1、2、4mg／ml）范圍內劑量依賴性的誘導RAW264.7細胞分泌 TNF－α，當作用劑量為4mg／ml時 TNF－α產量與 LPS（1μg／ml）作用時相當［12］。此外，當以小鼠腹腔巨噬細胞作為實驗模型時，靈芝孢子多糖GSG可以在50～200μg／ml范圍內劑量依 賴 性 的 誘 導 細 胞 分 泌 TNF－α 和 IL－6［13］。 而Chang lu Wang等從白靈菇中獲得一種水溶性多糖蛋白復合物PN50G，可以刺激RAW264.7細胞分泌促炎癥因子TNF－α和IL－6，同時也能促進抗炎癥因子IL－10的分泌，當用LPS刺激RAW264.7細胞構建炎癥模型后，用PN50G處理，發(fā)現可以顯著下調 TNF－α、IL－6、IL－10的分泌，這顯示了其具有雙向免疫調節(jié)作用［14］。

1.3 對吞噬活性的影響 吞噬活性是巨噬細胞展示其免疫防衛(wèi)作用的重要功能，當機體受到病原微生物入侵或機體出現變異細胞或細胞碎片時，巨噬細胞可以吞噬和消化這些內外源性異物，然后將其遞呈給淋巴細胞，進一步提升適應性免疫應答［15］。不少微生物來源的多糖都可以增強巨噬細胞的吞噬活性。Bai Y等從一種南極海洋適冷菌Pseudoaltermonas sp.S－5的發(fā)酵液中分離純化得到一種雜多糖PEP，發(fā)現其在5～200μg／ml范圍內可以顯著提升小鼠腹腔巨噬細胞吞噬酵母顆粒的能力，在50μg／ml的劑量下吞噬活性最強［16］。Hiroaki Kojima等從香菇子實體中分離純化得到兩個多糖片段IA－a和IA－b，使用熒光微球吞噬實驗和流式細胞儀檢測，發(fā)現IA－a，IA－b均可顯著增強 RAW264.7細胞的吞噬活性［17］。一種從細腳擬青霉中分離純化得到的多糖PtP可以在0.125～0.5mg／ml范圍內可以顯著促進人單核巨噬細胞吞噬中性紅，當劑量在0.25mg／ml時吞噬活性最強［18］。

1.4 對其他功能的影響 用來源于白靈菇的多糖蛋白復合物PN50G（5～40μg／ml）處理RAW264.7細胞后于電鏡下觀察，發(fā)現該多糖蛋白復合物可以明顯促使該細胞發(fā)生形態(tài)變化，其中在20μg／ml劑量作用下效果最強，細胞體積增大，形態(tài)由圓形變?yōu)椴灰?guī)則，并伸出樹突狀偽足，這些形態(tài)變化說明了細胞的黏附和吞噬活性增強［14］。ROS（Reactive oxygen species）是需氧細胞在代謝中產生的一系列活性氧簇，在細胞凋亡的調控和轉錄因子的激活方面扮演了重要角色，具有廣泛的生理意義。來源于松茸的多糖片段 TmC－2可以在（1、2、4mg／ml）范圍內劑量依賴性的提高RAW264.7細胞內的ROS水平，而來源于南極海洋適冷菌Pseudoaltermonas sp.S－5發(fā)酵液的雜多糖PEP雖然能夠上調小鼠腹腔巨噬細胞的免疫活性，但卻沒有影響ROS的產量，這可能與該多糖無法刺激特定的信號通路有關［16］。此外，從細腳擬青霉中得到的多糖PtP可以明顯提升小鼠腹腔巨噬細胞、肺泡巨噬細胞、人單核巨噬細胞中LDH和ACP的水平，LDH和ACP是巨噬細胞的標志酶，PtP能夠提升LDH和ACP水平意味著PtP能夠激活這三種不同的巨噬細胞［18］。

2 微生物多糖激活巨噬細胞免疫調節(jié)作用的機制

近年來隨著研究的不斷深入，人們對微生物多糖激活巨噬細胞的免疫調節(jié)作用的研究已經達到分子受體水平，經研究發(fā)現微生物多糖可以與巨噬細胞表面的模式識別受體 （Pattern recognition receptor，PRR）結合，繼而啟動免疫應答，從而發(fā)揮免疫調節(jié)作用。能夠識別微生物多糖類的PRR主要有：TLR2，4受體、Dectin－1受體、β－葡聚糖受體、CD14、補體受體3（CR3）［19～22］。微生物多糖與 PRR 的結合可觸發(fā)下游信號分子的產生，繼而引發(fā)胞內一系列信號級聯(lián)反應，導致轉錄因子的激活，誘導相關免疫基因表達，激活免疫反應。目前文獻報道的微生物多糖多是與巨噬細胞表面TLR受體結合激活核轉錄因子NF－κB和絲裂原活化蛋白激酶 MAPKS（包括ERK，JNK，和P38）信號轉導途徑發(fā)揮免疫調節(jié)作用。例如來源于蟬擬青霉菌絲體的多糖PCP可以通過與巨噬細胞表面的TLR4受體結合，激活 MAPKS和NF－κB進而誘導巨噬細胞產生NO和分泌細胞因子。當用TLR4siRNA將TLR4基因沉默，用MAPKS和NF－κB的特異性抑制劑處理細胞后，均可以明顯下調PCP對巨噬細胞的免疫刺激作用［23］。當用 TLR2、TLR4、CR3抗體處理小鼠腹腔巨噬細胞后，發(fā)現只有TLR4抗體處理后可以顯著下調豬苓來源的多糖PPS誘導巨噬細胞分泌IL－1β和TNF－α，這說明該多糖是與巨噬細胞表面的TLR4受體結合而發(fā)揮其免疫調節(jié)作用［24］。來源于海洋絲狀真菌YS4108的菌絲體的α－葡聚糖YCP可以與巨噬細胞表面的TLR4和CR3兩種受體結合，激活P38MAPK，刺激巨噬細胞產生NO［9］而從紫芝發(fā)酵液中分離純化得到一種胞外多糖片段PS－F2，可以與RAW264.7細胞表面的多種受體（TLR4、CR3、Dectin－1）結合，激活syk，NF－κB和MAPKS，最終誘導 TNF－α的分泌［25］。

細胞信號轉導通路十分復雜，且不同通路之間往往相互影響、交互調控，一種微生物多糖可以同時與細胞表面多種受體結合，在不同水平不同環(huán)節(jié)同時調節(jié)多種信號通路。微生物多糖所具有的免疫活性與其對細胞信號轉導通路的影響密切相關，從細胞水平和分子水平闡明微生物多糖激活巨噬細胞的信號轉導通路，對于將具有良好免疫活性的微生物多糖開發(fā)成為新型免疫治療藥物具有重要意義。

3 結語

微生物來源的多糖因為具有易生產、產量高、分離純化簡單等優(yōu)點而具有很高的應用價值和廣闊的發(fā)展前景。經研究發(fā)現許多微生物來源的多糖都可以通過與巨噬細胞表面的模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRR）結合，激活胞內一系列信號級聯(lián)反應，最終增強巨噬細胞功能，如促進巨噬細胞成熟，增強其吞噬活性，促進細胞信號分子產生和細胞因子的分泌，達到增強機體免疫力的目的。通過研究微生物多糖激活巨噬細胞的分子機制可以從細胞水平和分子水平闡明微生物多糖發(fā)揮免疫調節(jié)作用的機制，為今后探尋和開發(fā)具有免疫調節(jié)活性的微生物多糖提供參考。

［1］Birk RW，Gratchev A，Hakiy N，et al.Alternative activation of antigen－presenting cells：concepts and clinical relevance〔J〕.Hautarzt，2001，52（3）：193－200.

［2］Leung MYK，Liu C，Koon JCM，et al.Polysaccharide biological response modifiers〔J〕.Immunol Lett，2006，105（2）：101－114.

［3］Lingen MW.Role of leukocytes and endothelial cells in the development of angiogenesis in inflammation and wound healing〔J〕.Arch Pathol Lab Med，2001，125（1）：67－71.

［4］Klimp AH，de Vries EG，Scherphof GL，et al.A potential role of macrophage activation in the treatment of cancer〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol，2002，44（2）：143－161.

［5］Schepetkin IA，Quinn MT.Botanical polysaccharides：Macrophage immunomodulation and therapeutic potential〔J〕.Int lmmunopharmacol，2006，6（3）：317－333.

［6］Knight JA.Free radicals，antioxidants and the immune system〔J〕.Ann Clin Lab Sci，2000，30（2）：145－158.

［7］Li HT，Zhao BL，Hou JW，et al.Two－peak kinetic curve of the chemiluminescence in phorbol－induced macrophage〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1996，223（2）：311－314.

［8］Chang ZQ，Lee JS，Hwang MH，et al.A novel beta－glucan produced by Paenibacillus polymyxa JB115induces nitric oxide production in RAW264.7macrophages〔J〕.J Vet Sci，2009，10（2）：165－167.

［9］Yao JF，Wu L，Wu XZ，et al.Immuno－enhancing effect of YCP obtained from a marine filamentous fungus Keissleriella sp.YS 4108on mice peritoneal macrophage〔J〕.J China Pharm Univ，2004，35：573－575.

［10］Xiaojuan Xu，Chen Pan，Lina Zhang，et al.Immunomodulatory β－Glucan from Lentinus edodes Activates Mitogen－activated Protein Kinases and Nuclear Factor－κ B in Murine RAW 264.7Macrophages〔J〕.J Biol Chem，2011，286：31194－31198.

［11］Belska NV，Guriev AM，Danilets MG，et al.Water－soluble polysaccharide obtained from Acorus calamus L.classically activates macrophages and stimulates Th1response〔J〕.Int Immunopharmacol，2010，10（8）：933－942.

［12］Se Eun Byeon，Jaehwi Lee，Eunji Le，et al.eFunctional Activation of Macrophages，Monocytes and Splenic Lymphocytes by Polysaccharide Fraction from Tricholoma matsutake〔J〕.Arch Pharm Res，2009，32（11）：1565－1572.

［13］Liang Guo，Jianhui Xie，Yuanyuan Ruan，et al.Characterization and immunostimulatory activity of a polysaccharide from the spores of Ganoderma lucidum 〔J〕.International Immunopharmacology，2009，（9）：1175－1182.

［14］Changlu Wang，Haiyan Cui，Yurong Wang，et al.Bidirectional Immunomodulatory Activities of Polysaccharides Purified From Pleurotus nebrodensis〔J〕.Inflammation，2014，37（1）：83－93.

［15］Takahashi K，Yamazaki M，Abe S.Local induction of a tumor necrosis factor（TNF）－like cytotoxic factor in murine tissues with tumorous and nontumorous inflammation after systemic administration of antitumor polysaccharides〔J〕.J Pharmacobiodynam，1988，11（7）：472－478.

［16］Bai Y，Zhang P，Chen G，et al.Macrophage immunomodulatory activity of extracellular polysaccharide（PEP）of Antarctic bacterium Pseudoaltermonas sp.S－5〔J〕.Int Immunopharmacol，2012，12（4）：611－617.

［17］Hiroaki Kojima，Junji Akaki，Satomi Nakajima，et al.Structural analysis of glycogen－like polysaccharides having macrophage－activating activity in extracts of Lentinula edodes mycelia〔J〕.J Nat Med，2010，64：16－23.

［18］Xiaoming Chen，Jianxin Lu，Yangde Zhang，et al.Studies of macrophage immuno－modulating activity of polysaccharides isolated from Paecilomyces tenuipes〔J〕.International Journal of Biological Macromolecules，2008，43：252－256.

［19］Laechini AH，Davies AJ，Mackintosh D，et al.Beta－1，3－glucan modulates PKC signalling in Lymnaea stagnalis defence cells：a role for PKC in H2O2production and downstream ERK activation〔J〕.J Exp Biol，2006，209（Pt 24）：4829－4840.

［20］Gangloff SC，Zahringer U，Blondin C，et al.Influence of CD14 on ligand interactions between lipopolysaccharide and its receptor complex〔J〕.J Immunol，2005，175（6）：3940－3945.

［21］Yan J，Vetvicka V，Xia Y，et al.Critical role of Kupfer cell CR3 （CD1lb／CD18）in the clearance of IgM－opsonized erytllmcytes or soluble beta－glucan〔J〕.Immunopharmacology，2000，46（1）：39－54.

［22］Eberle ME，Dalpke AH.Dectin－1stimulation induces suppressor of cytokine signaling thereby modulating TLR signaling and T cell responses〔J〕.J Immunol，2012，188（11）：5644－5654.

［23］Hyung Sook Kim，Yeon Jin Kim，Hong Kyung Lee，et al.Activation of macrophages by polysaccharide isolated from Paecilomyces cicadae through toll－like receptor 4〔J〕.Food and Chemical Toxicology，2012，50：3190－3197.

［24］Xingqun Li，Wen Xu.TLR4－mediated activation of macrophages by the polysaccharide fraction from Polyporus umbellatus（pers.）Fries〔J〕.Journal of Ethnopharmacology，2011，135：1－6.

［25］Cheng－Li Wang，Chiu－Ying Lu，Chia－Chen Pi，et al.Extracellular polysaccharides produced by Ganoderma formosanum stimulate macrophage activation via multiple pattern－recognition receptors〔J〕.BMC Complementary and Alternative Medicine，2012，12：119