梅毒實驗室診斷方法進(jìn)展與評價

曾雪梅

廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣西南寧市 530021

梅毒是由梅毒蒼白螺旋體（Treponema pallidum，TP）感染而引起的一種性傳播疾病，常累及生殖器官、附屬淋巴結(jié)等，并能引起全身性病變的慢性傳染病。近年來，由于梅毒感染率增加十分迅速，梅毒已成為國際社會共同關(guān)注的一個社會性問題［1］。梅毒與艾滋病有著共同的傳播途徑，因此梅毒的防治，對艾滋病的防控有著重要的意義。由于至今尚未建立梅毒螺旋體的體外培養(yǎng)方法，實驗室主要從病原學(xué)、血清學(xué)及分子生物學(xué)等技術(shù)方面進(jìn)行檢測。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，近年來，快速靈敏、準(zhǔn)確性及特異性均高的梅毒診斷技術(shù)得到不斷地更新完善，現(xiàn)綜述如下。

1 梅毒螺旋體病原學(xué)檢查

1.1 暗視野顯微鏡檢查和活檢 多用于起病初期，在病灶中采集分泌物后立即做暗視野顯微鏡觀察，可以直接鏡檢到梅毒螺旋體（TP），對Ⅰ、Ⅱ期梅毒診斷具有重要價值，具有簡便、快速、易于操作的特點(diǎn)。但該方法多受檢驗人員技術(shù)水平和經(jīng)驗等外部因素的影響，且不能區(qū)分梅毒螺旋體及其他類似梅毒螺旋體的物質(zhì)，敏感性與特異性較低。梅毒螺旋體只能在活體內(nèi)繁殖，不能在體外培養(yǎng)，主要對眼前房和兔睪丸敏感。但因操作復(fù)雜、檢測時效和成本等原因，除研究外一般不做兔睪丸感染試驗。

1.2 多功能顯微診斷儀（MDI）［2］是近年來，由國外開發(fā)的一種暗視野、偏振光及綜合相差對比的可變投影顯微鏡。該儀器集合了醫(yī)學(xué)影像學(xué)、光電學(xué)、電子學(xué)和計算機(jī)等技術(shù)于一身。標(biāo)本不需要任何加工處理即可直接進(jìn)行觀察，其優(yōu)點(diǎn)在于分辨率高（最高可達(dá)0.2μm）、放大倍數(shù)高、清晰度高等。主要用于一期梅毒的診斷，具有準(zhǔn)確方便、快速直接的特點(diǎn)［3］，其缺點(diǎn)為設(shè)備昂貴，該方法在臨床上還未廣泛推廣應(yīng)用。

2 血清學(xué)檢測技術(shù)

由于梅毒自然病程存在潛伏期，血清學(xué)診斷是梅毒診斷（特別是潛伏期和晚期梅毒診斷）的重要手段。選擇特異性、敏感性均高的血清學(xué)檢測方法對梅毒的預(yù)防和診療都十分重要，梅毒血清學(xué)檢測分為非特異性抗體及特異性抗體檢測兩大類。

2.1 梅毒螺旋體非特異性抗體檢測技術(shù) 非特異性抗體檢測方法名稱很多，包括不加熱血清反應(yīng)素試驗（USR）、性病研究實驗室試驗（VDRL）、梅毒甲基胺紅不加熱血清試驗（TRUST）、快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗（RPR）等。這些方法的原理基本相同，主要是梅毒螺旋體進(jìn)入人體后，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗心磷脂抗體（即反應(yīng)素），試驗采用的抗原為卵磷脂、心磷脂與膽固醇的混合物，抗原－抗體以一定比例相互作用時出現(xiàn)凝集反應(yīng)。主要差異是吸附抗心磷脂類抗原的物質(zhì)不同，為了便于肉眼觀察到陽性的凝集現(xiàn)象，常把抗原結(jié)合到有色物質(zhì)上，如TRUST用甲基胺紅，凝集顆粒呈紅色，RPR試驗用活性炭，凝集顆粒呈黑色等。這些試驗簡單快速、試劑成本低，適宜基層和人群篩查，是國內(nèi)目前普遍使用的方法，其中最常用TRUST。它們均可做定性和半定量，主要是根據(jù)滴度數(shù)值判斷梅毒的療效、復(fù)發(fā)或再感染［4］。梅毒滴度是判斷梅毒治療及療效轉(zhuǎn)歸的重要指標(biāo)之一［5］。同時感染梅毒后，患者血清中產(chǎn)生抗類脂抗原抗體，多在梅毒感染3～4周后，在此之前檢測可能出現(xiàn)假陰性反應(yīng)，非特異性抗體實驗特異性不高。在很多疾病過程如瘧疾、結(jié)核和麻風(fēng)等，機(jī)體可能會產(chǎn)生抗類脂抗原抗體，出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。此外，懷孕、腫瘤、吸毒和結(jié)締組織疾病等都有可能造成非梅毒螺旋體抗體檢查的假陽性［6］。故應(yīng)同時結(jié)合其他梅毒螺旋體特異性抗體試驗。

2.2 梅毒螺旋體特異性抗體檢測技術(shù) 其原理是隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用梅毒螺旋體或其成分作抗原，檢測患者血清中的梅毒螺旋體抗體，該檢測技術(shù)特異性和敏感性均較高，為梅毒確診實驗。

2.2.1 梅毒螺旋體血凝試驗（TPHA）。將特異性TP抗原致敏羊紅細(xì)胞，這類紅細(xì)胞與患者血清中的梅毒螺旋體抗體結(jié)合，產(chǎn)生肉眼可見的凝集反應(yīng)。實驗中使用血清吸收劑，去除了各種非特異性抗體的干擾，提高了TPHA的敏感性和特異性。但試劑成本較高，易自凝，不適用批量檢測，常用作梅毒的確認(rèn)試驗［7］。

2.2.2 梅毒螺旋體顆粒凝集試驗（TPPA）。與TPHA原理基本相同，主要的區(qū)別在于特異性TP抗原致敏的是明膠顆粒，試劑制備過程中不存在非特異抗原的干擾，并能測定抗體的效價，具有高敏感性和特異性，一般用于梅毒的確證。但該類方法檢測的是梅毒螺旋體混合抗體IgM和IgG，患者血清中IgG抗體可終身陽性。因此不能僅憑TP抗體陽性而診斷為梅毒，梅毒的診斷應(yīng)以癥狀、體征、病史以及實驗室檢測結(jié)果進(jìn)行綜合分析［8］。

2.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。為雙抗原夾心法，其原理是將高純度的特異性TP抗原包被微板，測血清中梅毒螺旋體抗體。目前已有多種商品化試劑盒，在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用［9，10］。ELISA法簡便快捷，影響因素較少。近年來隨著基因克隆技術(shù)的發(fā)展，采用基因重組表達(dá)的特異性TP抗原包被固相板，使該方法具有更高的敏感性和特異性。李仕娟［11］報道 TRUST 法與 ELISA 法只有71.15%的陽性符合率，而TPPA法與ELISA法有99.12%的陽性符合率，因此用于篩查梅毒時，ELISA法檢出率會明顯高于TRUST法，是目前篩查梅毒的較理想方法。而且適用于大批量樣品的檢測，自動化的操作方法，結(jié)果更為客觀準(zhǔn)確［12］。

2.2.4 膠體金層析法（CGD）。其原理是在檢測膜的檢測線上包被有基因重組TP抗原，當(dāng)加入樣品后，如果樣品中含有梅毒螺旋體抗體，將會與包被的特異性TP抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，而凝聚顯色［13］。該方法檢測的樣本可以是血漿、血清、全血，并且準(zhǔn)確率相對較高，具有簡單、快速、不需要特殊儀器等特點(diǎn)［14］。主要用于獻(xiàn)血者篩查、性病門診快速檢測，以及緊急用血等特殊情況。但與ELISA法檢測結(jié)果比較，存在顯著差異，可能因出現(xiàn)“前帶現(xiàn)象”，有一定漏檢率［15］。強(qiáng)陽性標(biāo)本會出現(xiàn)假陰性結(jié)果，需對樣本進(jìn)行稀釋處理。

2.2.5 免疫印跡法（WB）。是一種借助抗原鑒定特異性TP抗體的有效方法，該法是通過特異性TP抗體作為探針，與附著于固相支持物的通過電泳分離出來的特異性抗原表位發(fā)生特異性結(jié)合，是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。它結(jié)合了分子生物學(xué)和免疫學(xué)的特點(diǎn)，雖然特異性與敏感性都較高，但因檢測過程操作繁瑣，不適合于大批量的標(biāo)本檢測。同時試劑成本較高等，其在臨床中尚未得到廣泛應(yīng)用［16］。

2.2.6 化學(xué)發(fā)光法（CLIA）。是酶免疫技術(shù)發(fā)展的結(jié)果，采用多種特異性TP抗原包被固相發(fā)光微孔板，用辣根過氧化物酶標(biāo)記作為標(biāo)記抗原，與樣本中的梅毒螺旋體抗體特異性結(jié)合，形成雙抗原夾心復(fù)合物后，加入化學(xué)發(fā)光底物液，測定其發(fā)光值，判斷結(jié)果。CLIA是一種新型標(biāo)記免疫測定技術(shù)，用于微量抗原或抗體檢測。國內(nèi)一些研究表明：CLIA法具有操作簡便，結(jié)果易于保存，敏感度和特異度較高等優(yōu)點(diǎn)［17，18］，CLIA 法可以實現(xiàn)全自動化檢測，適用于大批量樣本的檢測，該方法得到越來越廣泛的認(rèn)可。

2.3 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù) 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）是檢測梅毒螺旋體的先進(jìn)方法。該方法的主要原理是通過持續(xù)進(jìn)行變性、退火、延伸，在體外大量擴(kuò)增模板DNA。選擇PCR診斷梅毒需要考慮患者所處的梅毒病程，及樣本來源以潰瘍和皮損拭子最為適宜。梅毒實驗室診斷方法主要是血清學(xué)檢測，但因人體感染梅毒后，要4～10周才產(chǎn)生一定數(shù)量的抗體，PCR可直接檢測梅毒螺旋體特異性基因片段，其特異性、敏感性均高于血清學(xué)方法［19］，尤其在早期梅毒診斷中意義重大。目前用于梅毒診斷的PCR技術(shù)主要有三種：即常規(guī)PCR、巢式PCR和熒光PCR。常規(guī)的PCR法檢測梅毒會出現(xiàn)一定假陰性，目前采用巢式PCR可提高對梅毒的檢出率。對于用血清學(xué)方法檢測為陰性或無法確證的結(jié)果，可采用巢式PCR檢測進(jìn)行確診［20］。熒光PCR對一期梅毒的診斷，具有很高的敏感性和特異性，可作為一期梅毒診斷的依據(jù)，對診斷二期梅毒不如血清學(xué)方法［21］。PCR檢測技術(shù)自身存在一些不足之處，易受樣本中細(xì)胞碎片和組織等物質(zhì)影響，對部分樣本如血清（全血）、腦脊液等敏感度低，出現(xiàn)漏診，同時對實驗室條件及操作人員技術(shù)要求較高。

3 結(jié)語

梅毒的檢測技術(shù)在近年來得到快速發(fā)展，特異性和靈敏度不斷得到了提高，檢測方法快速簡便。但所有的梅毒實驗室診斷方法都有其局限性，有特殊的應(yīng)用范圍，原理和臨床意義各不相同，由于梅毒血清學(xué)檢測存在血清固定現(xiàn)象，檢測結(jié)果存在一定限制。目前還沒有單一的一種實驗室方法，能完全診斷出梅毒感染及病程。血清學(xué)檢測仍然是梅毒螺旋體實驗室診斷的主要方法，多為非特異性抗體與特異性抗體聯(lián)合檢測。梅毒螺旋體非特異性抗體檢測常用于大范圍篩查，特異性抗體檢測主要用于確證。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR檢測技術(shù)已廣泛深入到生命科學(xué)研究領(lǐng)域，是梅毒實驗室診斷的新方法，對早期梅毒、神經(jīng)梅毒和伴艾滋病感染梅毒等診斷顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢。在診斷梅毒時，實驗室應(yīng)充分結(jié)合臨床，根據(jù)具體情形加以選擇檢測方法，需要綜合考慮檢測目的、特異性和敏感性、操作流程、樣本數(shù)量、試劑價格等因素。對檢測技術(shù)進(jìn)行組合優(yōu)化，建議兩種或兩種以上檢測方法聯(lián)合應(yīng)用，能有效提高梅毒檢出率，對梅毒的早診斷、早治療及控制梅毒蔓延有著重要意義［22］。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，更多有效可靠的梅毒實驗檢測新技術(shù)將應(yīng)用于臨床，需要今后不斷地總結(jié)研究。

［1］李靜，趙媛春，楊麗.3585例婚前醫(yī)學(xué)檢查人群梅毒感染情況分析〔J〕.中外醫(yī)學(xué)研究，2011，9（28）：26－27.

［2］朱慧蘭，武明昌.多功能顯微診斷儀在Ⅰ期梅毒診斷中臨床價值的初步評價〔J〕.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2001，17（1）：33.

［3］尹躍平.梅毒血清學(xué)檢測方法的應(yīng)用評價〔J〕.實用醫(yī)院臨床雜志，2006，3（2）：11－13.

［4］Ebel A，Vanneste L，Cardinaels M，et al.Validation of the INNO－LIA syphilis kit as confirmatory assay for treponema pallidumantibodies〔J〕.J Clin Microbiol，2000，38（1）：215－219.

［5］莫坤.梅毒規(guī)范治療后血清滴度變化的臨床意義〔J〕.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（33）：32－33.

［6］尹建奇，劉平英.2592份血清中梅毒血清學(xué)生物學(xué)假陽性結(jié)果的臨床分析〔J〕.中國皮膚性病學(xué)雜志，2001，15（5）：33－34.

［7］姚衛(wèi)，李紅霞，江智輝，等.梅毒血清學(xué)檢測的適宜方法探討〔J〕.寄生蟲病與感染性疾病，2008，6（2）：64－65.

［8］郭秀儀，袁詩雅，王莉，等.12103例梅毒抗體檢測陽性率分析〔J〕.中外醫(yī)學(xué)研究，2014，12（7）：54－55.

［9］Aktas G，Young H，Moyes A，et al.Evaluation of the serodia Treponema pallidum particle agglutination，the Murex Syphilis ICE and the Enzywell TP tests for serodiagnosis of syphilis〔J〕.Int J STD AIDS，2005，16（4）：294－298.

［10］張華榮，董國富，雷紅宇，等.5種梅毒檢測方法的應(yīng)用評估〔J〕.中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2007，30（4）：193－204.

［11］李仕娟.TRUST與TP－ELISA同步聯(lián)合檢測在梅毒診斷中的臨床應(yīng)用〔J〕.中外醫(yī)學(xué)研究，2011，9（22）：50－51.

［12］康淑霞，朱安友，王鳳超，等.ELISA 法篩查聯(lián)合TRUST、TPPA在梅毒診斷中的應(yīng)用價值〔J〕.實用全科醫(yī)學(xué)，2007，6（5）：545－546.

［13］李佳.梅毒螺旋體抗體金標(biāo)法檢測漏檢原因分析與對策〔J〕.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2012，9（15）：81－82.

［14］游曉敏，宋紅蓮.對比分析三種不同方法檢測梅毒螺旋體的結(jié)果準(zhǔn)確性〔J〕.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（18）：96－97.

［15］文海燕，張華榮，陳正明，等.梅毒檢測方法的研究進(jìn)展〔J〕.中國皮膚性病學(xué)雜志，2012，26（4）：354－356.

［16］呂金偉，程周祥.梅毒檢測方法概述〔J〕.安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2013，19（1）：26－27.

［17］孫俊，劉美華，閆忠，等.兩種梅毒檢測方法的比較〔J〕.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2011，8（9）：1039－1041.

［18］張振國，樂宏元，周曉維，等.幾種梅毒螺旋體抗體檢測方法的應(yīng)用評價〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2009，47（16）：108－110.

［19］劉紅杏，牛淑芳.梅毒螺旋體檢測的實驗研究進(jìn)展〔J〕.中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8（6）：1043－1044.

［20］McIver CJ，Rismanto N，Smith C，et al.Multiplex PCR testingdetected higher than expected rates of cervical Mycoplasmas，Ureaplasmas，Trichomonas and viral agents in sexually active Australian women〔J〕.J Clin Microbiol，2009，47（5）：1358－1363.

［21］張思平，胡白，劉金麗，等.熒光PCR在早期梅毒患者診斷中的應(yīng)用〔J〕.中國皮膚性病學(xué)雜志，2008，22（3）：182－183.

［22］歐慧.三種梅毒血清學(xué)檢驗方法在臨床中的應(yīng)用〔J〕.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（22）：80－81.