丹參制劑高效液相色譜指紋圖譜研究現狀

張 珺，程月發

(河北聯合大學冀唐學院，河北唐山063300)

1 指紋圖譜技術應用于丹參制劑質量標準研究的重要性

質量控制是中藥現代化的重要內容，也是中藥產業發展的瓶頸問題。現行的中藥質量標準主要包括性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別及對某些藥材的1～2個指標成分進行含量測定［1］。然而，中醫理論強調整體效應，重視多個化學成分在藥效上的協同作用，僅以少數成分作為定性、定量的指標遠不能從整體上反映藥材的質量，因此建立從整體上綜合評價中藥質量的方法是尤為重要的。近年來，將中藥指紋圖譜用于中藥質量控制已成為人們的共識［2～4］。如美國食品藥品監督管理局(FDA)和歐盟醫藥管理局(EMA)均在有關植物草藥指南中將指紋圖譜作為混合物的質量控制方法［5，6］;我國國家藥典委員會發布的“2010年版《中國藥典》中藥質量標準研究制定技術要求”，明確將中藥指紋圖譜作為中藥鑒別和質量評價的一種方法，并對中藥指紋圖譜分析方法的建立、方法的驗證、數據處理和計算分析等提出了具體要求(見國藥典中發［2008］349號文件)。由此可見，采用指紋圖譜質控技術，有望顯著改善中藥現代化的內涵，提高中藥生產的現代化程度。

丹參作為傳統中藥，具有活血化瘀、涼血消癰和清心除煩的功效。其中有效成分主要包含兩大類:具有水溶性的酚酸類成分和脂溶性的二萜醌類成分，其成方制劑在臨床上應用廣泛。目前，市場上的丹參劑型品種較多，主要分為兩大類，一類是只以丹參藥材入藥，包括丹參片、丹參注射液、丹參膠囊和丹參顆粒等;另一類以丹參為君藥，由丹參、三七等中藥組成，包括復方丹參片、復方丹參滴丸、復方丹參顆粒、香丹注射液、丹參粉針劑、冠心丹參片和冠心丹參膠囊等。《中國藥典》2010年版(一部)收錄的丹參制劑有丹參片、復方丹參片、復方丹參滴丸和復方丹參顆粒，其中丹參片、復方丹參片和復方丹參顆粒是以丹參酮IIA和丹酚酸B的含量作為質量標準的，而復方丹參滴丸以丹參素的含量為質控指標［1］。然而現代藥理學研究表明丹參制劑中很多化學成分藥效都十分顯著［7～9］，不能忽略其中各種不同性質成分的藥效作用，因此很難從一種或幾種指標成分的含量來評價丹參制劑的質量。另外，近幾年由于丹參制劑的無序開發加大了其質量監管難度，在調查研究中發現同一種指標成分在不同廠家或同一廠家生產的不同批次的丹參制劑中含量差別較大。在本實驗室的研究中也發現丹參膠囊中的一些成分如丹酚酸B、丹參素等在不同或同一廠家生產的不同批次的藥品中含量存在一定差異［10，11］。顯然，現行的丹參制劑相關質量控制標準是亟需改進的，建立一種新方法來全面有效評價丹參制劑的質量體系是十分必需的。現今公認中藥指紋圖譜技術是在現有條件下對中藥材、中成藥進行質量控制的最好解決方法，尤其在現階段中藥的有效成分絕大多數沒有明確，采用中藥指紋圖譜的方式，可以有效地表征中藥質量和穩定性，還能夠反映不同批次藥物制品間質量的穩定性和一致性［12］。該項技術已逐漸被應用于建立丹參及其制劑質量標準的實驗方法研究中［13～15］。

2 不同丹參劑型的指紋圖譜在中藥質量控制方面研究現狀

目前，在中藥質量控制方面主要以中藥化學指紋圖譜中的色譜指紋圖譜特別是HPLC-DAD首選方法［4，14］，針對不同的丹參劑型進行研究。

2.1 丹參注射液指紋圖譜 丹參注射液主要由丹參藥材加工而成，為部頒標準收載品種。該劑型主要成分為水溶性的酚酸類化合物，質量標準僅以非主要活性成分原兒茶醛的含量作為質控指標，為完善其質量標準，一些研究采用指紋圖譜的方法來評價產品質量。施超歐等［16］在早前利用LCMS法建立了丹參注射液的HPLC圖，通過對比標準品及質譜分析確認了樣品中5個水溶性成分，并指出其所測得丹參注射液中沒有脂溶性成分，主要成分為水溶性的多羥基酚酸類化合物。雖然由于實驗方法的局限性沒有確認出更多的化學成分，但是這一研究為后來建立丹參注射液HPLC指紋圖譜的色譜條件提供參考依據。陶金成等［17］測定了不同廠家不同批次的復方丹參注射液的指紋圖譜，確立了19個共有峰，并指認了丹參素、原兒茶醛及丹酚酸B的色譜峰，該指紋圖譜特征明顯，指紋圖譜分析結果表明不同廠家的注射液中特征成分含量差異較大，有的甚至不符合相關規定。由此看出，加強中藥注射液的質量標準的控制和統一是非常必要的。李婧等［18］在丹參注射液指紋圖譜研究中，確立了20個共有峰，并指認出5個特征的水溶性成分，為全面評價該制劑質量提供有效方法之一。Liu等［14］研究了丹參及其注射液中全成分的指紋圖譜，并釆用標準品對照法和HPLC-MS聯用技術確認了丹參中的34種成分，通過指紋圖譜相似度評價分析結果表明該項技術能夠對于丹參及其制劑的質量控制是合理有效的。張妍［19］對28批注射用丹參凍干粉指紋圖譜進行了繪制，發現了28個共有峰，并指認出7個有效成分，為實現全面、快速、有效的評價丹參凍干粉提供質量控制模式。最近，Huang等［20］采用HPLC-UV和近紅外光譜方法對來自3個不同廠家的共計50多個批次的丹參注射液進行圖譜分析，相似度計算采用主成分分析(PCA)模型，組分鑒別用線性判別分析和近鄰算法(k-NN)，另外通過計算Hotelling T2和DModX(Distance to model X block)統計量，建立質量監控圖。結果發現，3廠家56批次產品的HPLC圖譜存在14個共有峰，相同廠家的產品有一定的穩定性，但不同廠家之間的產品存在較大的差異，特別是在230～375 nm間，譜峰變異較大。

為了更全面有效控制丹參注射液的質量，應從原料藥到藥物中間體到產品進行質量監控，以免影響藥品質量。在“中藥注射劑指紋圖譜研究技術要求”中也明確提出了方法學中應對中藥材、有效部位、中間體和注射劑之間的相關性進行研究。近年來，一些關于丹參及含有丹參注射劑的研究也集中于此，張尊建等［21］采用HPLC-UV-MS法建立了丹參藥材、丹參注射液中間體及丹參注射液的三種指紋圖譜，認為三種圖譜中具有一定相關性，但是在制備工藝過程中一些成分發生了化學變化致使這些成分在不同圖譜中變化較大，雖然成分的鑒定及變化過程尚未明確，但是這項研究為指紋圖譜從源頭上全面控制丹參注射液的質量提供了一種新思路。Zhang等［22］的研究也表明丹參注射液及其原藥材的指紋圖譜中一些成分及含量存在差異，該項研究中還測定了不同批次的丹參注射液，并確認了11個水溶性成分的特征峰，且發現丹酚酸類活性物質在大鼠血漿中的代謝存在很大差異。張曉茹等［23］建立了注射用丹參粉針劑-中間體-藥材HPLC指紋圖譜，研究表明三者相關性良好，并指出丹酚酸B在制備過程中分解為原兒茶醛和丹參素，因此在注射劑中沒有檢測到丹酚酸B。

此外，還有一些研究不僅局限在丹參注射液的化學成分的指紋上，還研究了藥效指紋圖譜。Chang等［24］對不同廠家丹參注射液藥效指紋圖譜進行了聚類分析，研究了化學成分與藥效(譜-效)相關性，并指出該方法對丹參注射液質量控制更為有效。

2.2 丹參片指紋圖譜 丹參片是臨床常用的一種中成藥，它是由單味丹參提取浸膏后制成的，為中國藥典收載品種，在治療冠心病、腦梗死等疾病上療效理想。但目前丹參片的指紋圖譜研究還相對較少，張青云等［25］僅建立了丹參片中脂溶性成分HPLC指紋圖譜的測定方法，但是對于非脂溶性成分指紋圖譜并沒有研究，而雷敏等［26］只建立了丹參片水溶性成分的HPLC指紋圖譜。這些并不足以全面評價丹參片的質量，但是也為完善指紋圖譜作為丹參片的質量控制手段提供了一些依據。張聰等［27］通過建立丹參藥材、中間體及丹參片的HPLC指紋圖譜，揭示了中藥制劑與原藥材和中間體的基源相關性，并探討了不同類型的成分在制備過程中的變化情況及原因。

2.3 復方丹參片指紋圖譜 復方丹參片是1975年由上海中藥二廠研制出的復方制劑，由丹參浸膏、三七和冰片組成，《中國藥典》1977年版至2010年版均有收錄，是臨床治療冠心病、胸悶和心絞痛的常用中成藥。由于其療效確切，不良反應少，價格低廉，市場需求量大，因此生產廠家也較多，但是不同廠家的技術設備條件及原料藥的差異，勢必引起產品質量的差異。為了全面有效的控制復方丹參片的質量，曾令杰等［28］首次采用了有效成分的定量分析和指紋圖譜相結合的方法對不同廠家的復方丹參片進行評價。該法能夠將復方丹參片中的水溶性成分和脂溶性成分在同一圖譜上表現出來，圖譜中共有10個特征性的指紋峰，并確認了丹參酮ⅡA、丹酚酸B和丹參素3種活性成分，可以說為全面評價復方丹參片等復方丹參制劑的質量奠定基礎。孫守國［29］建立的復方丹參片指紋圖譜中共存在20個共有峰，而黃琳等［30］構建的復方丹參片HPLC指紋圖譜中有25個共有特征峰，并確認了8個主要成分的色譜峰。王穎［31］在復方丹參片的指紋圖譜中標定出了8個指紋特征峰并分析其歸屬，為復方丹參片有效成分的追蹤分離及中成藥的二次開發奠定了基礎。勾曉洲等［32］則通過復方丹參片HPLC指紋圖譜考察了共有成分的不同時間內的穩定性。雷敏等［26］雖建立了復方丹參片水溶性成分HPLC指紋圖譜，但在這項研究中卻探討了一些水溶性成分從原料藥到成品制劑中含量的變化，指出臨床上主要以丹參水溶性成分入藥的丹參制劑，需要嚴格控制在制備工藝過程中主要有效成分的變化，以保證臨床用藥的有效性。

一些研究不僅僅只停留在復方丹參片指紋圖譜方法的確立上，還進一步深入研究了復方丹參片標準指紋圖譜的建立方法。孫國祥等［33，34］以雙定性相似度均值和雙定量相似度均值為參量，通過對20批復方丹參片進行系統聚類分析，確定用其中10批生成復方丹參片標準指紋圖譜，以此圖譜為標準對總計20批復方丹參片采用雙定性雙定量相似度法進行質量評價。該法確定40個指紋共有峰，不僅能反映了批次間的差異，對產品的穩定性和真實性的評價也較為理想;而后又采用多級系統指紋定量法應用于復方丹參片HPLC指紋圖譜評價［35］。嚴玉平等［36］以中位數法模擬了復方丹參片的對照指紋圖譜并同法同時測定丹參酮ⅡA的含量。

2.4 復方丹參滴丸指紋圖譜 1997年12月9日，復方丹參滴丸以藥品的身份正式通過美國食品與藥物管理局的臨床用藥申請，成為我國第一個通過美國FDA的臨床用新藥申請的中藥制劑，實現了中藥正式進入國際醫藥主流市場的歷史性突破，并被國家列為臨床急救必備的藥物之一，影響廣泛［37］。該藥也是目前藥典標準中收錄有標準指紋圖譜的唯一丹參類制劑。2004年天津天士力制藥股份有限公司在承擔國家科技攻關計劃—指紋圖譜應用示范研究時，創建了多元化學指紋圖譜技術，該技術對復方丹參滴丸的主要化學成分進行了系統分析，鑒定出10種丹參水溶性成分和20種三七皂苷類成分，較完整地表征了復方丹參滴丸的整體化學組成特征。它不僅首次創造性地提出多元化學指紋圖譜技術概念及其技術方法學，建立了復方丹參滴丸指紋圖譜分析方法，同時還首次研制創建了多元指紋圖譜相似度計算分析軟件系統，保證了研究結果的可驗證性和科學嚴謹性［38］。此后一些研究也集中建立用多元化學指紋圖譜來控制復方丹參滴丸的質量。范驍輝等［39］也采用多元復方丹參滴丸HPLC指紋圖譜考察了產品批次間質量的穩定性，該法分別建立了產品中丹參酚酸類成分和三七皂苷類成分的HPLC指紋圖譜，為提高復方丹參滴丸的質量標準提供了依據。Fan等［40］采用二元色譜指紋圖譜技術繪制了復方丹參滴丸中丹參和三七兩種成分的指紋圖譜。

同樣如復方丹參片，一些研究也關注復方丹參滴丸指紋圖譜的評價方法。孫國祥等［41～43］采用雙定性雙定量相似度作為評價指標，分別建立了復方丹參滴丸及其在低波長紫外吸收指紋成分的控制方法，實現了對復方丹參滴丸全面數字化的信息質量控制。此外關于復方丹參滴丸的毛細管電泳指紋圖譜也有研究［44，45］，為復方丹參滴丸質量控制提供了新的參考。

3 結語與展望

綜上所述，中藥指紋圖譜是一種綜合、可量化的手段，它與現行的單一指標成分或活性成分為測定標準的方法相比，其所含的信息更為科學合理。目前，指紋圖譜研究仍然局限于少數的丹參制劑，主要有丹參注射液、丹參片、復方丹參片和復方丹參滴丸等，而HPLC指紋圖譜上升為《中國藥典》2010年版(一部)標準的只有復方丹參滴丸，仍有幾十種丹參制劑的質量標準缺乏指紋圖譜要求。由此可見，關于丹參制劑指紋圖譜的標準圖譜的研究應進一步深入和完善，特別是藥典收錄的品種，應該盡早將有關標準指紋圖譜列入藥品質量管理文件，以規范丹參藥品的活性組分，達到保證藥品質量的目的。

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