超高效液相色譜串聯質譜法測定獸藥中3種違禁雌激素

郭捷 花錦 王蓉珍 田海嬌

1（山西省分析科學研究院，山西太原030006）

2（山西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，山西太原030024）

·食品分析·

超高效液相色譜串聯質譜法測定獸藥中3種違禁雌激素

郭捷1*花錦2王蓉珍1田海嬌1

1（山西省分析科學研究院，山西太原030006）

2（山西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，山西太原030024）

建立了飼料級獸藥制劑中違禁藥物己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚的超高效液相色譜串聯質譜檢測方法。用無水乙醇超聲提取試樣中3種雌激素，以乙腈-水作流動相進行梯度洗脫，采用電噴霧電離方式（ESI-），通過多反應監測（MRM）定量。該方法靈敏度高，線性關系良好，相關系數達到0.99，回收率在70.9%～98.8%之間，相對標準偏差（RSD）均小于8.3%。本方法快速、簡便、精確度高、準確度高，適用于獸藥制劑中己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚違法添加的定性、定量分析。

高效液相色譜-串聯質譜；獸藥制劑；雌激素；違禁藥物

雌激素作為內分泌干擾物之一，有研究表明兒童性早熟、男性前列腺癌、婦女乳腺癌和子宮癌發病率的上升與食品中雌激素的殘留有關。我國農業部第193號公告里禁止性激素和具有雌激素樣作用的物質在食品動物中的使用。己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚為雌激素，很多養殖戶對其毒副作用了解不足，常在動物飼養中用作生長素且用藥劑量偏高，常造成中毒。因此，為保障食品的安全，內源性和外源性雌激素同時檢測就顯得尤為重要。

目前獸藥制劑中己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚的常用檢測方法是氣相質譜色譜法（GC-MS）、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質譜聯用法（LC-MS）以及熒光光度法（FS）和毛細管電泳法（CAE）等。而對超高效液相色譜-四級桿串聯質譜法（UHPLC-MS/MS）的報道甚少，但其具有靈敏度更高、進樣更快速、更高效等優勢。本文以現有的文獻為基礎，采用超高效液相色譜-串聯質譜法對獸藥制劑中3種雌激素添加量進行檢測分析，該方法檢測靈敏度高、專屬性強，對保障獸藥安全具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色譜儀，美國Waters公司；TQD串聯四極桿質譜儀，美國Waters公司；TALBOYS渦旋混合器；Ultra turrax IKA T18超聲波。

乙腈、甲醇，色譜純，美國Fisher公司；無水乙醇，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；試驗用水均為蒸餾水。

己烯雌酚，純度98.00%；雙烯雌酚，純度100%；己烷雌酚，純度99.80%，國家生物制品所提供。準確稱取的己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚標準品各10.0 mg，用甲醇分別溶解并準確定容到10 mL，制備成質量濃度為1 000 μg/mL的標準儲備液，該溶液可在0℃～4℃冰箱中保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

本試驗通過參考文獻對多種提取方法進行對比后，采用超聲萃取法，簡單高效。取1.0 g樣品，加入2 mL無水乙醇溶液，后超聲10 min，將樣液過孔徑0.22 μm濾膜至進樣瓶，進行LC-MS/MS分析。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：BEHC18柱（50mm×2.1mm，1.8μm）；柱溫：35℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：乙腈和水，梯度洗脫程序見表1。

1.2.3 質譜條件

電離方式：電噴霧電離（ESI-）；掃描方式：負離子掃描；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：380℃；錐孔氣流：氮氣，流速50 L/h；去溶劑氣流：氮氣，流速600 L/h；碰撞氣：氬氣；碰撞氣壓：3.50×10-4Mpa；毛細管電壓：3.5 kV；檢測方式：多反應監測（MRM），多反應監測條件見表2。

以現場油井5個月的實際日產油量為依據，對樁59-X30井的生產情況進行歷史擬合，通過調節相滲曲線，擬合產油量與實際日產油量。

表1 梯度洗脫程序

表2 離子對、錐孔電壓、碰撞能量

2 試驗結果

2.1 方法的線性范圍

準確移取一定體積的標準儲備液，用甲醇稀釋成適當質量濃度的標準中間工作液。根據樣液中3種雌激素的含量情況，選定峰高相近的標準工作溶液。用甲醇將3種雌激素標準溶液稀釋至適當質量濃度（0.00 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.50 mg/L）進行測定，以峰面積（Y軸）對相應的質量濃度（X軸）作圖，結果表明己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚溶液質量濃度與對應的峰面積呈現良好的線性關系，相關系數均大于0.997 3。以信噪比（S/N）≥10計算，飼料及獸藥中己烯雌酚、己二烯雌酚和己烷雌酚的測定低限均為0.2 mg/kg。

2.2 方法的回收率與精密度

按照SN/T 0001標準的規定，禁用物質或未設定容許限的物質，一般選擇LOQ、2LOQ、10LOQ作為添加濃度水平進行回收率試驗，本方法檢測樣品中3種雌激素的含量較低，故采用不含以上3種雌激素的的空白樣品基質進行3個濃度水平（0.2 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kg）的添加回收試驗，測得3種物質的回收率范圍在70.9%～98.8%之間，RSD范圍均在8.3%以下。

表3 LC/MS/MS法檢測己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚的回收率和精密度

2.3 結果計算

采用外標法定量，按下式計算樣品中3種雌激素的含量，計算結果需扣除空白值。

式中：Xi──試樣中雌激素含量，mg/kg；

Ci──試液中雌激素質量濃度，μg/L；

V──試樣溶液定容體積，mL；

m──試樣溶液所代表試樣的質量，g；

R──回收率，%。

3 討論

3.1 流動相的優化

流動相的組成是影響待測物質分離效果和保留時間的重要因素，試驗考察了甲醇-水和乙腈-水2種流動相對3種激素的分離效果，結果表明，以甲醇-水作流動相時，3種雌激素分離的峰型不理想，己烯雌酚的峰形出現拖尾；以乙腈-水作流動相效果較好。

3.2 儀器條件的優化

采用自動進樣，在負離子模式下進行條件優化；選擇己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚的最佳分子離子峰及其錐孔電壓，然后再對進行一對碎片選擇及碰撞能量進行優化；在此優化條件下，3種雌激素的標準溶液色譜圖分別見圖1，圖2，圖3。

圖1 己烯雌酚（0.1 mg/kg）多反應監測標準色譜圖

圖2 雙烯雌酚（0.1 mg/kg）多反應監測標準色譜圖

圖3 己烷雌酚（0.1 mg/kg）多反應監測標準色譜圖

3.3 不同獸藥制劑中3種雌激素非法添加的檢測

按照建立的方法對市面上收集的15批獸藥制劑喹氟寧、替米考星溶液、氟苯尼考粉、桿痢清、霉毒凈、護肝顆粒、蒙脫石粉、藍天酵素菌、呼支暢、桉薄溶液、硫酸頭孢喹肟乳房注入劑（泌乳期）、注射用黃連、防己合劑、鹽酸沃尼妙林、鹽酸沃尼妙林預混劑10%進行己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚非法添加的普查，15份獸藥制劑均未檢出3種雌激素添加。

4 結論

文中建立了超高效液相色譜串聯質譜-電噴霧負離子測定飼料級獸藥制劑中非法添加物己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚的檢測方法，該法快速、簡單、有效、回收率高，可很大程度上降低日常檢測過程中的檢測成本，縮短檢測周期，為檢測獸藥制劑中非法添加己烯雌酚、雙烯雌酚和己烷雌酚提供了有效的前處理方法和檢測手段。

［1］王和興，周穎，姜慶五.超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜法同時分析奶粉中9種雌激素［J］.分析化學，2011，39（9）:1 323-1 328.

［2］鐘惠英，柴麗月，楊家鋒，等.動物肌肉中己烯雌酚、雙烯雌酚、已烷雌酚和雙酚A的測定［J］.分析試驗室，2013，32（12）:116-121.

［3］陳溪.GC-MS法同時檢測動物組織中多種性激素類獸藥殘留的研究［D］.大連：大連工業大學，2008.

［4］劉宏程，黎其萬，佴注，等.HPLC測定動物組織中己烯雌酚、呋喃唑酮、磺胺類藥物殘留［J］.化學通報，2006（1）: 66-69.

［5］薛敏，王安，王瑜，等.分子印跡固相萃取技術檢測江水、尿液及牛奶中雌激素殘留［J］.分析化學，2011，39（6）:793-798.

［6］LI GUOLIANG，DONG LIHUA，WANG AIHONG，et al. Simultaneous determination of biogenic amines and estrogens in foodstuff by an improved HPLC method combining with fluorescence labeling［J］.Food Science and Technology，2014，55（1）:355-361.

［7］周建科，張前莉，韓康，等.中老年奶粉中雙酚A和己烯雌酚的反相高效液相色譜測定［J］.食品工業科技，2007，28（2）:233-234；145.

［8］李冉，章竹君，付愛華，等.高效液相色譜化學發光法測定人血清及動物組織中的己烯雌酚［J］.分析試驗室，2012，31（8）:23-26.

［9］劉宏程，鄒艷紅，黎其萬，等.高效液相色譜分離牛奶中己烯雌酚、己烷雌酚和雙烯雌酚［J］.分析化學，2008，32（2）:245-248.

［10］趙永綱，陳曉紅，姚珊珊，等.分散固相萃取-超快速液相色譜-串聯質譜法測定牛蛙全血中6種酚類環境雌激素［J］.色譜，2012，30（7）:665-671.

［11］XU CHUANLAI，PENG CHIFANG，LIU LIQIANG，et al. Determination of hexoestrol residues in animal tissues based on enzyme-linked immunosorbent assay and comparison with liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2006，41（3）：1 029-1 036.

［12］陳眷華，王文博，徐在品，等.己烯雌酚殘留的三種檢測方法比較研究［J］.食品科學，2006，27（9）：214-218.

［13］陳荷蓮，張曉慧.動物源食品雌激素檢測的樣品前處理技術進展［J］.教育教學論壇，2014（8）:119-120.

Determination of three prohibited estrogens in feed grade veterinary preparations by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

GUO Jie1*HUA Jin2WANG Rong-zhen1TIAN Hai-jiao1

1（Shanxi academy of analytical sciences，Shanxi Taiyuan030006，China）

2（Shanxi entry-exit inspection and quarantine bureau，Shanxi Taiyuan030024，China）

A method of determination of illegal drugs diethylstilbestrol,dienestrol，and hexoestrolin feed grade veterinary preparations by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS)was developed.Three kinds of estrogens in samples were extracted by ultrasound with ethanol.A gradient system of acetonitrile and water with multi-reaction monitoring（MRM）was employed for quantitative determination.This method has high sensitivity and good linear relationship，the correlation rate was 0.99.The average recoveries ranged from70.9%to98.8% with relative standard deviation less than 8.3%.The determination method was characterized by simplicity,higher sensitivity,and accuracy.It is suitable for qualitative and quantitative analysis of illegal drugs diethylstilbestrol,dienestrol and hexoestrolin feed grade veterinary preparation.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；veterinary preparations；estrogens；illegal drugs

TS202.3

A

1673-6044（2014）04-0048-05

10.3969/j.issn.1673-6044.2014.04.015

*郭捷，女，1963年出生，1985年畢業于山西大學分析化學專業，高級工程師。

2014-12-01