人肝細胞癌組織中葉酸受體和Delta樣配體4的表達及分布

王曉輝，惠 玲，羅 蕓

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的消化系統惡性腫瘤之一［1］。我國HCC發病人數占全球的55%，且隨著乙型慢性肝炎、肝硬化等肝臟疾病發生率的升高，HCC發病率亦逐年上升［2］。HCC起病隱匿，確診時往往已是中晚期，加上合并肝硬化等多方面原因，以手術切除為主的綜合治療能夠消除HCC局部病灶，但其5年復發、轉移率仍然＞50%［3］。隨著腫瘤治療技術的不斷發展，分子靶向治療、免疫治療、基因治療等手段已成為HCC治療的希望。分子靶向治療針對腫瘤組織中特異性分子靶點，通過干預及調控相關信號傳導通路，從而抑制腫瘤生長、發展及轉移［4］。本研究采用免疫組化及Western blot方法檢測葉酸受體(FR)和Delta樣配體4(Dll4)在HCC組織及正常肝組織中的表達及分布特點，探討FR及Dll4作為HCC分子靶向治療新靶點的可能性。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器 兔抗人FR、Dll4單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，兔抗人β-actin單克隆抗體、羊抗兔IgG-HRP、卵白素-生物素復合物、DAB顯色試劑購自北京中杉金橋公司。ECL超敏化學發光液購自武漢博士德公司。2235型石蠟切片機為德國萊卡公司產品，IX-71型活細胞成像工作站為日本Olympus公司產品，ChemiDoc型化學發光成像系統為美國UVP公司產品，Mini-PROTEAN蛋白凝膠電泳系統為美國Bio-Rad公司產品。

1.2 組織標本獲取 經蘭州軍區蘭州總醫院醫學倫理學委員會批準，并經患者知情同意后，隨機選取我院肝膽外科2013年1—10月根治性手術切除HCC標本24例，術前未經放化療等治療，男15例，女9例，年齡(56.35±9.76)歲;9例正常肝組織為同期肝血管瘤旁切除肝組織，男4例，女5例，年齡(48.76±5.18)歲，兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P＞0.05)。所有標本離體后，液氮速凍保存，部分取出于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.3 HE染色判斷組織類型 經多聚甲醛固定的組織梯度乙醇脫水(由低到高)，二甲苯透明，浸蠟包埋。切片機將組織切為5μm薄片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水(由高到低)，蘇木素染色15 min。1%鹽酸乙醇液分化，漂洗，脫水，0.5%伊紅乙醇溶液復染2 min。再經梯度乙醇脫水(由低到高)，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察組織結構。

1.4 免疫組化染色及結果判定 切片脫蠟，梯度乙醇復水，3.0%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，0.01 mol/L枸櫞酸鈉抗原修復15 min，蒸餾水清洗2次。加入5.0%的BSA封閉液，37℃孵育30 min。分別加入免抗人FR、Dll4單抗，4℃過夜，PBS清洗3次。滴加生物素標記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育30 min，PBS清洗3次。滴加SABC試劑，室溫孵育30 min，PBS清洗5次。DAB室溫顯色20 min，蘇木素復染，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。結果判定:鏡下隨機觀察5個非重疊視野(×400)，根據棕黃色染色陽性細胞所占百分比計分:＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分;陽性細胞染色強度計分:無色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，褐色3分。采用強度×百分比判定，＞3分為陽性。

1.5 Western blot檢測FR及Dll4的表達 取小塊液氮凍存組織，加入300μl RIPA細胞裂解液，低溫條件下組織勻漿，冰浴30 min，BCA法蛋白定量。100μg總蛋白行12%SDS-PAGE凝膠電泳，300 mA恒流電轉40 min，將蛋白轉移至硝酸素纖維膜(NC膜)。將NC膜置于5%脫脂奶粉封閉1 h，加入1∶500稀釋的兔抗人 β-actin、FR、Dll4單抗4℃孵育過夜。加入1∶1000稀釋的羊抗兔IgG-HRP二抗，37℃孵育2 h，ECL超敏化學發光液顯色，ChemiDoc型化學發光自動成像系統拍照并半定量分析。

1.6 統計學方法 應用SPSS 13.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(x±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗;計數資料以率(%)表示，采用χ2檢驗，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 正常肝組織及HCC組織的形態學觀察 正常肝組織中，細胞索排列整齊，以中央靜脈為中心放射狀排列，肝竇正常，細胞呈多邊形，邊界清楚，胞核結構正常，位于細胞中央，胞質豐富，無明顯病變。HCC組織中，肝臟正常結構被腫瘤組織浸潤、破壞，細胞巢狀排列，體積增大，胞質豐富，呈多角形，細胞核形態多樣，大而深染，鏡下可見核分裂象，部分區域有假小葉形成或見肝細胞水變性、脂肪變等病毒性肝炎的病變特點，見圖1。

圖1 正常肝組織及肝細胞癌組織鏡下形態(HE×100)A.正常肝組織;B.肝細胞癌組織

2.2 FR及Dll4的表達 FR免疫組化染色結果顯示，在24例HCC組織中，22例呈陽性表達，其中強陽性8例，陽性12例，弱陽性2例，廣泛表達于腫瘤細胞的細胞膜及胞質中;而在9例正常肝組織中均表現為FR的陰性表達，見圖2。Dll4免疫組化染色結果顯示，在24例HCC組織中，23例呈陽性表達，其中強陽性15例，陽性6例，弱陽性2例，主要表達在腫瘤血管內皮細胞及周圍腫瘤細胞的細胞膜上;而在9例正常肝組織中3例呈弱陽性表達，見圖3。HCC組織中FR、Dll4陽性率均高于正常肝組織，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.3 Western blot檢測FR和Dll4的表達 提取冰凍組織的總蛋白，Western blot檢測正常肝組織及HCC組織中FR和Dll4的表達，并按照公式(目的蛋白的灰度值/內參蛋白的灰度值×100%)計算FR和Dll4的相對表達量。HCC組織中FR的相對表達量為(118.39±26.59)%，正常肝組織中未見FR的表達;HCC組織中Dll4的相對表達量為(145.81±33.61)%，正常肝組織中 Dll4的相對表達量為(45.18±17.90)%。HCC組織中FR和Dll4的相對表達量均高于正常肝組織，差異有統計學意義(P＜0.05)。進一步證實了，在HCC組織中FR蛋白特異性表達、Dll4蛋白高表達，而正常肝組織中Dll4蛋白低表達，FR蛋白不表達，見圖4。

圖2 正常肝組織及肝細胞癌組織中葉酸受體免疫組化染色結果(DAB×200)A.正常肝組織;B.肝細胞癌組織

圖3 正常肝組織及肝細胞癌組織中Delta樣配體4免疫組化染色結果(DAB×200)A.正常肝組織;B.肝細胞癌組織

表1 葉酸受體和Delta樣配體4在正常肝組織及肝細胞癌組織中的表達情況［例(%)］

圖4 Western blot檢測正常肝組織及肝細胞癌組織中FR和Dll4的表達 Dll4為Delta樣配體4，FR為葉酸受體，βactin和GAPDH均為內參照

3 討論

HCC作為常見的消化系統惡性腫瘤之一，手術局部病灶切除是其目前主要治療手段，但由于手術切除率低、術后易復發轉移等因素，患者的長期生存仍不理想。相對于傳統治療手段，分子靶向治療已經成為HCC治療發展的新方向。分子靶向治療通過局部給藥，在載體作用下，經血液循環選擇性地定位于靶器官富集，載體攜帶的藥物作用于靶細胞或細胞內特定結構［5］，具有靶向性和特異性強，毒副反應小，不易發生耐藥，能夠高效地殺傷腫瘤細胞而對正常組織損傷小等優點［6］。因此，HCC分子靶向治療的關鍵在于選擇靶向運送及藥物作用靶點。

腫瘤組織由腫瘤細胞及腫瘤微環境組成。腫瘤微環境由細胞外基質、成纖維細胞、血管或淋巴管和免疫細胞組成，影響腫瘤生長、轉移及抗癌藥物療效等［7］。在肝動脈化療栓塞治療HCC中，腫瘤血管新生是HCC復發、轉移的重要因素［8］。國外有報道曾經提出可通過阻斷腫瘤血管，抑制腫瘤生長和轉移，從而治療腫瘤［9］。目前以血管內皮生長因子(VEGF)及其受體為靶點的貝伐單抗和索拉非尼，已用于晚期HCC血管阻斷治療，具有一定效果，但其價格昂貴，且易出現多種嚴重毒副反應［10-11］。因此，探索毒副作用小、相對穩定的血管阻斷新靶點，對提高HCC療效有重要意義。

FR是一種糖基化磷脂酰肌醇連接的跨膜單鏈糖蛋白，與其配體5-甲基四氫葉酸及游離葉酸特異地具有強親和力，介導胞吞作用將葉酸修飾的藥物及載體高效、特異地導入細胞［12］。FR在正常組織中，一般無表達或少量選擇性地表達在極化的上皮細胞表面，使血液循環中葉酸修飾的藥物不能通過FR介導進入正常組織，而在多數腫瘤細胞膜表面FR則呈現過度表達狀態［13］。葉酸作為FR的配體，價格低廉，結構簡單，分子量小，免疫原性低，穩定性好，經修飾與藥物結合后仍可保持與FR的高度親和力。FA-藥物復合物通過FA與腫瘤組織高表達的FR特異性結合，局部細胞膜內陷形成早期核內體或“小泡”，發生了內吞作用。在內涵體的酸化作用下，FR的構型改變并轉移到細胞膜進行下次轉運，同時釋放出FA-藥物復合物，進而藥物與FA間的連接鍵斷裂，實現了攜帶的藥物在腫瘤細胞內部釋放［14］。因此利用FR在腫瘤和正常組織間的差異性表達、FR與FA及其衍生物特異性結合，可望實現藥物對腫瘤的靶向運送，FR已成為腫瘤診斷和治療研究的新靶點。本研究結果顯示，FR在HCC組織特異性表達，而在正常肝組織中無表達。因此，FR可作為HCC治療中藥物靶向運送載體的靶點。

Notch信號通路是一個在進化過程中高度保守的細胞間信號轉導通路，其中Dll4是Notch信號通路中的血管特異性配體，主要在新生血管的尖端細胞以及內皮細胞中表達，而在成熟的血管中較少表達［15］。Dll4在腫瘤組織中高表達，與腫瘤的惡性發展密切相關，對腫瘤發生、血管生成和血行轉移具有重要調控作用［16］。Dll4在小鼠 ColO205、HM7等腫瘤血管及其周圍組織表達明顯上調，與Notch1受體結合后可調控內皮細胞的生物活性，影響腫瘤血管的生成［17］。在人乳腺癌、腎癌和膀胱癌的腫瘤組織中，Dll4亦呈現異常高表達，并導致腫瘤血管的動靜脈分化［18］。新近的研究發現，VEGF和Dll4抑制劑聯合使用對一些anti-VEGF治療抵抗的腫瘤，抑瘤作用更明顯［19］。阻斷Dll4/Notch信號通路可使腫瘤無功能血管密度增加，從而致腫瘤血供不足、體積減小、血行轉移減少［20］，同時還可減少腫瘤干細胞的數量，促進腫瘤細胞凋亡［21］。

本研究結果顯示，HCC組織中Dll4蛋白高表達，主要表達在腫瘤血管內皮細胞及周圍腫瘤細胞的細胞膜上。因此，Dll4可作為HCC血管阻斷治療的新靶點，但其在體內應用還存在非特異免疫原性、穩定性差、細胞內導入能力弱等問題。病毒載體亦存在宿主免疫反應、潛在致癌性、包載基因容量有限以及靶向性差等缺陷，并且由于Dll4在正常組織中廣泛存在，對心血管發育、血管再生及動脈分化等具有調控作用，如果采用非靶向載體介導Dll4基因沉默，必將引起機體血管生成紊亂，產生嚴重的毒副反應。因而必須在HCC組織中尋找一個特異性的標志分子，作為Dll4分子藥物運送的靶點，以提高藥物作用的特異性，減輕毒副反應。

綜上所述，HCC組織特異性表達FR;在腫瘤血管內皮細胞及周圍腫瘤細胞的細胞膜上高度表達Dll4，因此，通過 FA修飾干擾Dll4表達的基因藥物，以FR為藥物運送靶點，Dll4為藥物作用靶點，有望實現HCC的血管阻斷靶向治療。

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